Legionella pneumophila에서 분비계 구성 요소의 극성 및 역학 정량화

초록

출처: Chetrit, D., et al. Legionella pneumophila dot/icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 생세포 이미징 및 냉동 전자 단층 촬영을 적용합니다. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 살아있는 세포 형광 이미징을 사용하여 레지오넬라 뉴모필라에서 분비계 구성 요소의 극성과 역학을 정량화하여 박테리아 병인을 이해하는 데 중요한 공간 모집 및 세포질 재분포를 분석하는 방법을 보여줍니다

프로토콜

1. Dot/ICM 구성 요소의 극성 국소화 및 역학의 정량화

메모: 다음 단계는 2 x 2 비닝으로 획득한 픽셀당 0.129μm의 이미지를 위해 설계되었습니다.

1. sfGFP(슈퍼폴더 녹색 형광 단백질) 융합 단백질의 극성 정량화(그림 1)
   1. 박테리아가 명확하게 보이도록 이미지 대비를 조정합니다. 영역 도구를 사용하여 극에서 시작하여 세포질로 확장되는 0.25 x 1.3 μm² 직사각형을 배치합니다. 직사각형은 박테리아 경계 내에 정확하게 유지되어야 합니다.
   2. 최소 200개의 박테리아를 표시하고 마 스킹할 영역 버튼을 사용하여 관심 영역에 대한 마스크를 만듭니다. 마스크 통계 및 마스크 범위에서 객체를 선택합니다. 그런 다음 기능 및 강도에서 평균 강도 및 분산을 표시합니다.
   3. 데이터를 내보내고 각 박테리아의 극성 점수를 분산과 평균 강도 사이의 비율로 계산합니다.
   4. 처리량이 많은 응용 프로그램의 경우 위상 대물렌즈 및 적절한 콘덴서 설정을 사용하여 위상 및 488 nm 채널로 이미지를 획득합니다. 박테리아가 완전히 분리된 시야를 선택해야 합니다.
   5. 박테리아가 명확하게 보이는 수준으로 이미지의 위상 채널 대비를 조정합니다. 듀얼 채널 이미지를 열고 세그먼트 마스크 생성 창을 실행한 다음 채널을 위상으로 변경합니다.
   6. 적절한 임계값을 조정하고 객체 정의 버튼을 사용하여 작은 객체를 제거합니다. 마스크 미세 조정에서 가장자리 개체 제거를 선택한 다음 나중에 서로 인접한 박테리아 마스크를 분리합니다.
   7. 이전에 1.1.2–1.1.3단계에서 설명한 대로 각 셀에 대한 488 채널의 신호 극성 점수를 계산합니다.
2. sfGFP 융합 단백질에 대한 역학 정량화(그림 2)
   메모: 역학은 시간 경과에 따른 강도의 변화로 정의되며 다음 단계는 짧은 이미징 기간(즉, 몇 분)을 위해 설계되었습니다. 더 긴 이미징 기간이 필요한 경우 패드에 적절한 보충제를 추가하십시오.
   1. 이미지 캡처 창에서 타임랩스를 표시하고 간격 상자에 간격 시간을 입력한 다음 # of Time Points 상자에 2를 입력합니다. 관심 있는 형광 단백질을 발현하는 Legionella pneumophila의 두 개의 연속 이미지를 획득합니다.
   2. 셀이 명확하게 보일 때까지 이미지 대비를 조정합니다. 그림 2A 와 아래 설명에 따라 세 가지 다른 마스크를 배치합니다. 영역 도구를 사용하여 최소 400개의 셀 중앙에 0.25 x 0.25μm 정사각형을 배치합니다.
   3. [ Region to Mask ] 버튼을 사용하여 관심 사각형의 마스크(마스크 1)를 만듭니다. 빈 마스크(마스크 2)를 새로 만들고 픽셀 도구 또는 다각형 도구를 사용하여 형광 표백을 계산하는 데 사용할 최소 25개의 임의 셀의 전체 셀 영역을 표시합니다. 새 빈 마스크(마스크 3)를 만들고 큰 브러시 도구를 사용하여 배경 빼기에 사용할 셀 사이의 영역을 표시합니다.
   4. 마스크 통계 및 마스크 범위에서 마스크 1 및 마스크 2에 대해 개체를 선택합니다. 그런 다음 기능 및 강도에서 평균 강도를 선택하고 두 마스크의 데이터를 내보냅니다. 마스크 3의 경우 전체 마스크의 평균 강도를 내보냅니다.
   5. 다음 공식을 사용하여 마스크 1의 각 물체에 대한 형광 강도의 변화를 계산합니다.

여기서 마스크 1은 셀 중심에 배치된 0.25μm × 0.25μm 정사각형이고, 마스크 2는 전체 셀을 덮고, 마스크 3은 셀 사이의 배경이며, T1은 첫 번째 시점의 평균 강도, T2는 두 번째 시점의 평균 강도입니다.

결과

그림 1: Dot/Icm 시스템 서브유닛의 극성 국소화의 정량화. (A) Lp01 에서 발현된 DotB-sfGFP의 실시간 시각화는 극성 국소화를 나타냈다. DotB-sfGFP는 전체 점/icm 유전자 클러스터가 삭제된 균주에서 발현될 때 확산 패턴을 나타냈습니다(∆T4SS). dotB 오페론에서 발현된 융합되지 않은 sfGFP는 확산 세포질 패턴을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100x Plan Apo 대물렌즈(1.4NA)	니콘
CoolSNAP EZ 20MHz 디지털 흑백 카메라	포토메트릭
현미경 커버 슬라이드 22x22mm	피셔 사이언티픽	12-542B
현미경 커버 슬라이드 24x50mm	피셔 사이언티픽	12-545케이
현미경 슬라이드 25x75x1mm	글로브 사이언티픽	1380
슬라이드북 6.0	지능형 이미징 혁신
Spectra X 라이트 엔진	루멘코르