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1. Dot/ICM 구성 요소의 극성 국소화 및 역학의 정량화
메모: 다음 단계는 2 x 2 비닝으로 획득한 픽셀당 0.129μm의 이미지를 위해 설계되었습니다.
- sfGFP(슈퍼폴더 녹색 형광 단백질) 융합 단백질의 극성 정량화(그림 1)
- 박테리아가 명확하게 보이도록 이미지 대비를 조정합니다. 영역 도구를 사용하여 극에서 시작하여 세포질로 확장되는 0.25 x 1.3 μm2 직사각형을 배치합니다. 직사각형은 박테리아 경계 내에 정확하게 유지되어야 합니다.
- 최소 200개의 박테리아를 표시하고 마 스킹할 영역 버튼을 사용하여 관심 영역에 대한 마스크를 만듭니다. 마스크 통계 및 마스크 범위에서 객체를 선택합니다. 그런 다음 기능 및 강도에서 평균 강도 및 분산을 표시합니다.
- 데이터를 내보내고 각 박테리아의 극성 점수를 분산과 평균 강도 사이의 비율로 계산합니다.
- 처리량이 많은 응용 프로그램의 경우 위상 대물렌즈 및 적절한 콘덴서 설정을 사용하여 위상 및 488 nm 채널로 이미지를 획득합니다. 박테리아가 완전히 분리된 시야를 선택해야 합니다.
- 박테리아가 명확하게 보이는 수준으로 이미지의 위상 채널 대비를 조정합니다. 듀얼 채널 이미지를 열고 세그먼트 마스크 생성 창을 실행한 다음 채널을 위상으로 변경합니다.
- 적절한 임계값을 조정하고 객체 정의 버튼을 사용하여 작은 객체를 제거합니다. 마스크 미세 조정에서 가장자리 개체 제거를 선택한 다음 나중에 서로 인접한 박테리아 마스크를 분리합니다.
- 이전에 1.1.2–1.1.3단계에서 설명한 대로 각 셀에 대한 488 채널의 신호 극성 점수를 계산합니다.
- sfGFP 융합 단백질에 대한 역학 정량화(그림 2)
메모: 역학은 시간 경과에 따른 강도의 변화로 정의되며 다음 단계는 짧은 이미징 기간(즉, 몇 분)을 위해 설계되었습니다. 더 긴 이미징 기간이 필요한 경우 패드에 적절한 보충제를 추가하십시오.- 이미지 캡처 창에서 타임랩스를 표시하고 간격 상자에 간격 시간을 입력한 다음 # of Time Points 상자에 2를 입력합니다. 관심 있는 형광 단백질을 발현하는 Legionella pneumophila의 두 개의 연속 이미지를 획득합니다.
- 셀이 명확하게 보일 때까지 이미지 대비를 조정합니다. 그림 2A 와 아래 설명에 따라 세 가지 다른 마스크를 배치합니다. 영역 도구를 사용하여 최소 400개의 셀 중앙에 0.25 x 0.25μm 정사각형을 배치합니다.
- [ Region to Mask ] 버튼을 사용하여 관심 사각형의 마스크(마스크 1)를 만듭니다. 빈 마스크(마스크 2)를 새로 만들고 픽셀 도구 또는 다각형 도구를 사용하여 형광 표백을 계산하는 데 사용할 최소 25개의 임의 셀의 전체 셀 영역을 표시합니다. 새 빈 마스크(마스크 3)를 만들고 큰 브러시 도구를 사용하여 배경 빼기에 사용할 셀 사이의 영역을 표시합니다.
- 마스크 통계 및 마스크 범위에서 마스크 1 및 마스크 2에 대해 개체를 선택합니다. 그런 다음 기능 및 강도에서 평균 강도를 선택하고 두 마스크의 데이터를 내보냅니다. 마스크 3의 경우 전체 마스크의 평균 강도를 내보냅니다.
- 다음 공식을 사용하여 마스크 1의 각 물체에 대한 형광 강도의 변화를 계산합니다.
여기서 마스크 1은 셀 중심에 배치된 0.25μm × 0.25μm 정사각형이고, 마스크 2는 전체 셀을 덮고, 마스크 3은 셀 사이의 배경이며, T1은 첫 번째 시점의 평균 강도, T2는 두 번째 시점의 평균 강도입니다.
