극저온 전자 단층 촬영을 위한 Legionella pneumophila 의 준비

초록

출처: Chetrit, D., et al. Legionella pneumophila dot/icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 생세포 이미징 및 냉동 전자 단층 촬영을 적용합니다. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 박테리아 배양, 금 나노입자 마킹 및 유리화 기술을 결합하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 레지오넬라 뉴모필라 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 공정은 천연 세포 구조를 보존하고 막 관련 분비 시스템 구성 요소의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

프로토콜

1. Cryo-ET를 사용한 sfGFP 질량 밀도 검출

1. 샘플 준비, 데이터 수집 및 재구성

1. 37°C에서 48시간 동안 CYE-한천-스트렙토마이신 플레이트에서 형광 태그가 지정된 Dot/Icm 단백질을 발현하는 레지오넬라 뉴모필라 의 무거운 패치를 성장시킵니다. 세포를 ddH₂O에서 OD₆₀₀ 0.7로 재현탁합니다. 5μL의 콜로이드 금 입자(BSA Tracer, 10nm)를 20μL의 세포 현탁액에 첨가합니다.

2. 세포 혼합물 5μL를 갓 방출된 구멍 구멍 탄소 그리드(Cu 200 메쉬의 R 2/1)에 피펫팅하고 1분 동안 그대로 둡니다. 여과지로 닦아내고 중력 구동 플런저 장치를 사용하여 액체 에탄에 동결합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10nm 콜로이드 금 입자	오리온	25486
100x Plan Apo 대물렌즈(1.4NA)	니콘
에이스	시그마-알드리치	A9758
CoolSNAP EZ 20MHz 디지털 흑백 카메라	포토메트릭
유전자 프레임, 1.7x2.8 cm, 125 μL	피셔 사이언티픽	AB-0578
홀리 카본 그리드 R 2/1 Cu 200 메쉬	콴티포일	Q225-CR1
질산철(III) 비수화물	시그마-알드리치	216828
극저온 EM용 K2 Summit 카메라	가탄
현미경 커버 슬라이드 22x22mm	피셔 사이언티픽	12-542B
현미경 커버 슬라이드 24x50mm	피셔 사이언티픽	12-545케이
현미경 슬라이드 25x75x1mm	글로브 사이언티픽	1380
슬라이드북 6.0	지능형 이미징 혁신
Spectra X 라이트 엔진	루멘코르