빠르게 성장하는 박테리아 비브리오 natriegens 배양

초록

출처: Wiegand, DJ, Lee, et al., 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens를 사용한 무세포 단백질 발현. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 조추출물 생성을 위한 박테리아 펠릿을 준비하기 위해 폭기 조건에서 빠르게 성장하는 박테리아인 Vibrio natriegens의 배양 및 수확을 보여줍니다.

프로토콜

Vibrio natriegens 조세포 추출물의 제조-박테리아 배양

1. 표 1에 따라 V. natriegens 박테리아 성장 배지 LB-V2(V2 염이 함유된 용해 성 국물)를 준비합니다. 고압멸균하여 성장 배지를 멸균합니다. 미디어가 실온(RT)에 도달하도록 합니다. RT에서 여분의 용지를 보관하십시오.
   주의: 오토클레이브를 작동할 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 실험실별 지침을 참조하십시오.
2. 야생형 V. natriegens 의 글리세롤 스톡을 사용하여 3mL의 LB-V2 배지를 접종합니다. 30 rpm으로 흔들면서 225 °C에서 밤새 성장시킵니다.
3. 탁상용 원심분리기에서 10,600 x g 으로 1분 동안 원심분리하여 하룻밤 배양액 1mL를 세척합니다. 생성된 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인하고 신선한 LB-V2 배지 1mL에 재현탁합니다.
4. 멸균 덮개가 있는 고압멸균된 4L 배플 삼각 플라스크에 신선한 LB-V2 성장 배지 1L를 추가합니다. 세척된 하룻밤 배양액 1mL(1:1,000 희석 비율)를 사용하여 접종합니다. 30 rpm으로 흔들면서 225 °C에서 배양액을 성장시킵니다.
   참고: V. natriegens 배양은 1:1,000 희석 비율을 유지하면서 확장 또는 축소할 수 있습니다. 예를 들어, 멸균 덮개가 있는 2L 배플 삼각 플라스크에 250mL의 신선한 LB-V2 성장 배지에 세척된 하룻밤 배양액 250μL를 첨가합니다.
5. 분광 광도계를 사용하여 배양액의 OD₆₀₀ 을 모니터링합니다. 배양액이 OD₆₀₀ = 1.0 ± 0.2에 도달하면 4°C에서 20분 동안 3,500 x g 으로 원심분리하여 배양액을 수확합니다. 펠릿을 얼음 위에 놓습니다.
   참고: V. natriegens 는 빠르게 성장하므로 배양에 대한 면밀한 모니터링이 필요합니다. OD₆₀₀ = 1.0으로의 성장은 1:1,000 희석 비율에서 약 1.5-2시간이 소요됩니다.
6. 상청액을 흡인하고 생성된 박테리아 펠릿을 즉시 -80°C에서 저장하거나 직접 세포 용해를 진행합니다.
   메모: 이 단계는 좋은 중지 지점입니다. 그러나 최상의 결과를 얻으려면 펠릿을 즉시 또는 1-2일 이내에 처리하는 것이 좋습니다.

표 1: 1L의 LB-V2 박테리아 성장 배지 제조를 위한 시약

표 1 A	LB-V2 박테리아 성장 배지의 준비
구성 요소	수량(g)	최종 농도 (mM)	최종 부피(L)
LB 육수(밀러)	25		1
나크롬	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
케이클	0.31	4.2
표 1 B	S30A 용해 완충액의 제조
구성 요소	수량(g)	최종 농도 (mM)	최종 부피(L)
트리스 용액(pH 8.0) - 1 M(mL)	25	50	0.5
Mg-글루타메이트	2.72	14
K-글루타메이트	6.10	60
디티오스레이톨(DTT) - 1M(mL)	1	2

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2 mL 튜브	에펜도르프	22363352
HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)	시그마	H3375
LB (루리아 베르타니) 육수 (밀러)	시그마	L3522
염화마그네슘(MgCl₂)	시그마	M8266
염화칼륨(KCl)	시그마	피9333
염화나트륨(NaCl)	시그마	S7653
트리스 용액(pH 8.0) - 1 m	인비트로젠	AM9856
Vibrio natriegens (야생형) 동결건조 주식	ATCC	14048