이 비디오는 높은 단백질 합성 속도로 잘 알려진 빠르게 성장하는 박테리아인 Vibrio natriegens에서 세포 추출물을 제조하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 펠릿은 세포 분해를 방지하기 위해 얼음 위에서 초음파 처리하기 전에 용해 완충액에 세척하고 재현탁합니다. 용해물을 원심분리하여 불용성 세포 파편을 분리하고, 세포 추출물을 수집하여 급속 냉동하여 향후 사용을 위해 보관합니다.
프로토콜
1. V. natriegens 조세포 추출물의 준비 – 박테리아 배양
표 1에 따라 V. natriegens 박테리아 성장 배지, 용원성 국물 버전 2(LB-V2)를 준비합니다. 고압멸균하여 성장 배지를 멸균합니다. 미디어가 실온(RT)에 도달하도록 합니다. RT에서 여분의 용지를 보관하십시오. 주의: 오토클레이브를 작동할 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 실험실별 지침을 참조하십시오.
야생형 V. natriegens 의 글리세롤 스톡을 사용하여 3mL의 LB-V2 배지를 접종합니다. 30 rpm으로 흔들면서 225 °C에서 밤새 성장시킵니다.
탁상용 원심분리기에서 10,600 x g 으로 1분 동안 원심분리하여 하룻밤 배양액 1mL를 세척합니다. 생성된 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인하고 신선한 LB-V2 배지 1mL에 재현탁합니다.
멸균 덮개가 있는 고압멸균된 4L 배플 삼각 플라스크에 신선한 LB-V2 성장 배지 1L를 추가합니다. 세척된 하룻밤 배양액 1mL(1:1,000 희석 비율)를 사용하여 접종합니다. 30 rpm으로 흔들면서 225 °C에서 배양액을 성장시킵니다. 참고: V. natriegens 배양은 1:1,000 희석 비율을 유지하면서 확장 또는 축소할 수 있습니다. 예를 들어, 멸균 덮개가 있는 2L 배플 삼각 플라스크에 250mL의 신선한 LB-V2 성장 배지에 세척된 하룻밤 배양액 250μL를 첨가합니다.
분광 광도계를 사용하여 배양액의 OD600 을 모니터링합니다. 배양액이 OD600 = 1.0 ± 0.2에 도달하면 4°C에서 20분 동안 3,500 x g 의 원심분리를 통해 배양액을 수확합니다. 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 참고: V. natriegens 는 빠르게 성장하므로 배양에 대한 면밀한 모니터링이 필요합니다. OD600 = 1.0으로의 성장은 1:1,000 희석 비율에서 약 1.5-2시간이 소요됩니다.
상청액을 흡인하고 생성된 박테리아 펠릿을 즉시 -80°C에서 저장하거나 섹션 2에 설명된 세포 용해를 직접 진행합니다. 메모: 이 단계는 좋은 중지 지점입니다. 그러나 최상의 결과를 얻으려면 펠릿을 즉시 또는 1-2일 이내에 처리하는 것이 좋습니다.
2. V. natriegens 조세포 추출물의 제조 – 세포 용해
멸균 탈이온화(DI) 물에서 표 1 에 따라 S30 용해 완충액을 준비하고 빙초산을 사용하여 pH를 7.7로 조정합니다. 주의: 빙초산은 pH를 조정할 때 적절한 PPE로 취급해야 합니다.
세포 용해 절차를 시작하기 전에 S30 용해 완충액을 냉장고 또는 얼음 위에서 약 4°C로 식힙니다. 메모: 빠른 냉각을 위해 용해 완충액을 -20°C에 놓을 수 있습니다. 버퍼가 얼지 않도록 하십시오.
세포 펠릿을 얼음 위에 10-20분 동안 또는 완전히 해동될 때까지 놓습니다. 10mL의 차가운 S30 용해 완충액을 사용하여 동일한 1L 배양액에서 생성된 모든 펠릿을 재현탁한 다음 현탁액을 50mL 튜브로 옮깁니다. 1.6단계에서 펠릿이 -80°C의 냉동실에서 동결되지 않은 경우 직접 재현탁을 진행합니다. 메모: 필요에 따라 펠릿을 초기에 재현탁하는 데 사용되는 S30 용해 완충액의 부피를 늘립니다.
4°C에서 10분 동안 3,500 x g 현탁액을 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인합니다. 10mL의 차가운 S30 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 두 번째로 세척합니다. 펠릿을 얼음 위에 놓습니다.
냉장실에서 50mL 튜브의 펠릿에 500μL의 차가운 S30 용해 완충액을 추가합니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 재현탁하고 전체 펠릿 현탁액을 2mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 메모: 와이드 보어 피펫을 사용할 수 없는 경우 가위를 사용하여 1mL 피펫 팁의 끝을 잘라 펠릿 이송을 위한 보어를 늘립니다.
부피를 크게 늘리지 않고 가능한 한 많은 펠릿을 옮깁니다. 그러나 펠릿은 2mL 튜브의 균질한 현탁액으로 표시된 대로 초음파 처리하기에 충분한 액체에 재현탁되어야 합니다. 2mL 튜브를 너무 많이 채우지 마십시오. 현탁액은 1.5mL를 초과해서는 안 됩니다. 필요한 경우 여러 튜브로 분할합니다.
세포 펠릿을 얼음 위에 보관하고 차가운 방에서 작업하십시오. 600mL 비커에 얼음을 채우고 얼음 위에 2mL 튜브 홀더를 놓습니다. 메모: 튜브 홀더를 비커 측면 근처에 배치하는 것이 도움이 되므로 초음파 처리 진행 상황을 모니터링하기 위해 펠릿 현탁액이 얼음에서 볼 수 있습니다( 그림 1 참조).
2mL 튜브에 펠릿을 소용돌이로 현탁시켜 세포를 균질화하고, 튜브를 튕겨 캡 바닥의 세포를 제거한 다음 캡을 연 상태에서 튜브 홀더에 넣습니다. 초음파 발생기 팁을 서스펜션으로 내려 액체 표면 바로 아래에 오도록 합니다.
그림 2에 표시된 대로 초음파 처리기 및 팁 직경이 1/8인치인 프로브를 사용하여 초음파 처리 설정을 준비합니다. 초음파 발생기 컨트롤에 다음 설정을 입력하십시오 : 20kHz 주파수 및 50 % 진폭, 펄스 ON 시간 : 10 초, 펄스 OFF 시간 : 60 초.
3 사이클 동안 펄스 초음파 처리 프로토콜을 실행하십시오. 펠릿 현탁액의 총 부피가 500 μL> 경우 펄스 초음파 처리 프로토콜을 6 번 실행합니다. 메모: 일반적으로 3-6 펄스는 V. natriegens 펠릿을 용해하기에 충분합니다. 초음파 발생기에 따라 추가 펄스가 필요할 수 있습니다. 초음파 처리하는 동안 조정 손잡이 플랫폼을 사용하여 프로브를 위아래로 움직여 튜브 바닥에 침전되었을 수 있는 펠릿을 용해합니다. 튜브를 홀더에서 제거하고 잠시 소용돌이를 일으켜 펄스 사이의 현탁액을 다시 균질화할 수 있습니다. 주의: 초음파 처리기가 활성화 될 때 적절한 청력 보호구를 착용하십시오.
초음파 처리 후, 조세포 추출물을 16,000 x g 에서 4°C에서 30-45분 동안 또는 그림 3에 표시된 것처럼 용해물에 세포 파편이 없을 때까지 원심분리합니다.
차가운 방에서 생성된 상청액 50μL를 펠릿을 방해하지 않고 새 2mL 튜브에 분취합니다. 메모: 실수로 새로운 2mL 튜브로 옮겨진 파편은 고수율 단백질 합성을 위한 추출물의 능력을 크게 감소시킵니다.
그림 4와 같이 딥핑 스트링이 부착된 튜브 홀더에 튜브를 넣어 조세포 추출물을 급속 동결합니다. 액체 질소가 들어 있는 듀어에 튜브를 담그고 사용할 때까지 즉시 -80°C의 냉동실에 넣으십시오. 주의: 실험실 가운, 보안경, 안면 보호대, 극저온 앞치마 및 장갑을 포함하여 액체 질소를 취급할 때 적절한 PPE를 사용하십시오.
표 1: 1L의 LB-V2 박테리아 성장 배지 및 0.5L의 S30A 세포 용해 완충액을 준비하기 위한 시약.
