이 비디오는 Vibrio natriegens 조 용해물을 기반으로 하는 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템을 사용하여 결합된 시험관 내 전사 및 번역을 수행하는 방법을 보여줍니다. 필수 성분이 포함된 마스터 믹스의 준비와 DNA 주형에서 기능성 단백질의 단계별 합성을 강조합니다.
각각 100mM 및 2000mM 농도의 멸균 DI(탈이온화) 물과 함께 50mL 튜브에 Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트의 작업 스톡을 준비합니다.
250mL 비커에 멸균 DI 물 100mL를 첨가하여 50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-8000의 작업 스톡을 준비합니다. 작은 마그네틱 교반기를 비커에 넣습니다. PEG-8000 50g의 무게를 측정하고 비커의 물 100mL에 첨가합니다.
100°C로 설정된 가열된 교반판에 비커를 놓고 PEG-8000이 용액에 들어갈 때까지 250rpm으로 저어줍니다. PEG-8000 액체 혼합물을 식힌 후 50mL 튜브로 옮깁니다.
에너지 솔루션 마스터 믹스
멸균 DI 물 500mL에 KOH 펠릿 140g을 첨가하여 5M KOH 용액을 준비합니다. 주의: 화학 후드에 이 용액을 준비하고 강한 베이스를 다룰 때는 PPE를 착용하십시오. 용액이 뜨거워지므로 압력이 쌓이는 것을 방지하기 위해 병뚜껑을 느슨하게 해야 합니다. 사용하기 전에 KOH 용액이 RT에 도달하도록 하십시오.
100mL 병에 20.85g의 HEPES를 첨가하여 1750mM HEPES-KOH 완충액을 준비합니다. 부피가 40mL에 도달할 때까지 멸균 DI수를 천천히 추가합니다. HEPES를 용해시키는 Vortex 병. 5M KOH 용액을 사용하여 pH를 8.0으로 조정한 다음 용액 부피를 50mL로 만듭니다. 주의: KOH는 pH를 조정할 때 적절한 PPE로 취급해야 합니다.
나머지 10x 에너지 마스터 믹스 스톡 성분을 멸균 DI 물에 표 1 에 표시된 농도로 준비하고 각 스톡을 얼음 위에 놓습니다. 100mM ATP, GTP, CTP 및 UTP 스톡을 RT에서 해동하고 얼음 위에 놓습니다. 메모: 필요한 경우 37°C 및 350rpm으로 설정된 열혼합기를 사용하여 시약을 용액에 용해시킬 수 있습니다. 과열하거나 시약을 열혼합기에 장시간 두지 마십시오.
15mL 튜브에 표 1에 지정된 순서와 부피에 따라 각 에너지 용액 마스터 믹스 성분을 추가합니다. 각 구성 요소가 추가된 후 용액을 소용돌이치게 합니다. 이렇게 하면 5mL의 10x 에너지 용액 마스터 믹스가 만들어집니다.
10x 에너지 용액 마스터 믹스를 2mL 튜브에 200μL 분취량으로 나눕니다. 각 분취량을 급속 동결합니다. 사용할 때까지 즉시 -80°C 냉동실에 넣으십시오.
아미노산 마스터 믹스
신선한 4x 아미노산 마스터 믹스를 준비하려면 먼저 RT에서 각 아미노산 스톡을 해동한 다음 각각을 얼음 위에 놓습니다. 37°C 및 350rpm으로 설정된 와류 및/또는 열혼합기를 사용하여 모든 아미노산 스톡이 완전히 용해되도록 합니다. 메모: 시스테인은 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 현탁액으로 아미노산 마스터 믹스에 첨가할 수 있습니다. 과열하거나 시약을 열혼합기에 장시간 두지 마십시오.
15mL 튜브에 멸균 DI 물에 적절한 양의 아미노산을 첨가하여 각각의 최종 농도가 ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU 및 CYS의 순서로 8mM이 되도록 합니다. 각 아미노산을 첨가한 후 마스터 믹스 용액을 소용돌이치십시오. 표 1 에 나열된 부피는 2.4mL의 아미노산 마스터 믹스를 구성합니다.
4x 아미노산 마스터 믹스를 2mL 튜브에 200μL 분취량으로 나눕니다. 각 분취량을 급속 동결합니다. 사용할 때까지 즉시 -80°C의 냉동실에 넣으십시오.
반응 준비가 된 플라스미드 DNA 템플릿 생산 메모: 이 시스템의 무세포 단백질 발현은 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 벡터 T7-pJL1-sfGFP(Table of Materials)를 사용하여 최적화되었습니다. 이 플라스미드를 무세포 반응 효율을 위한 대조군으로 사용하고 다른 단백질 서열의 클로닝 및 발현을 위한 pJL1 백본을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 플라스미드 DNA 주형을 사용할 수 있습니다. 그러나 전사는 T7 프로모터 서열과 T7 RNA 중합효소의 존재에 의해 제어된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 형질전환된 대장균 으로부터 임의의 플라스미드 DNA 주형을 대규모로 생산하기 위한 간단한 프로토콜은 아래에 설명되어 있습니다.
제조업체의 지침(재료 표)에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 원하는 벡터를 정제합니다. 참고: 플라스미드 DNA 주형을 가능한 한 많이 농축하는 것이 무세포 반응의 엄격한 부피 제약을 충족하는 것이 좋습니다. 일반적으로 750-1500ng/μL의 작업 스톡을 목표로 합니다.
2. V. natriegens Crude Extract를 이용한 무세포 단백질 발현 반응 수행
플라스미드 또는 선형 DNA 주형을 사용한 무세포 단백질 발현
-80°C 냉동고에서 10x 에너지 용액 마스터 믹스와 4x 아미노산 마스터 믹스 분취량을 꺼내 RT에서 해동한 다음 얼음 위에 올려 놓습니다. -20°C 냉동고에서 T7 RNA 중합효소 및 RNase 억제제 스톡을 꺼내 얼음 위에 놓습니다. RT에서 DNA 주형을 해동하고 얼음 위에 놓습니다.
각 성분을 얼음 위의 2mL 튜브에 다음 순서로 첨가하여 표 2 에 따라 무세포 반응 마스터 믹스를 준비합니다: 아미노산 마스터 믹스, 에너지 용액 마스터 믹스, Mg-글루타메이트, K-글루타메이트, DNA 주형, PEG-8000, T7 RNA 중합효소 및 RNase 억제제. 마스터 믹스에 첨가할 때마다 튜브를 부드럽게 튕깁니다. 메모: 무세포 단백질 발현에 선형 주형을 사용하는 경우 플라스미드 주형에 비해 5-10배 더 많은 물질을 추가하여 상당한 단백질 수율을 얻습니다.
V . natriegens 조세포 용해물을 -80°C 냉동고에서 제거하고 해동될 때까지 10-20분 동안 얼음 위에 놓습니다. 표 2 에 따라 적절한 부피의 조세포 추출물을 무세포 반응 마스터 믹스에 첨가하고 위아래로 튕기거나 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
열순환기를 사용한 종말점 무세포 단백질 발현
무세포 반응 마스터 믹스 10μL를 96웰 또는 384웰 PCR 플레이트의 바닥에 피펫팅합니다. PCR 플레이트로 옮기는 사이에 튜브를 부드럽게 넘겨 마스터 믹스를 혼합합니다. 메모: 무세포 반응 마스터 믹스는 모든 샘플에서 반응 재현성과 무세포 단백질 발현을 극대화하기 위해 항상 잘 혼합되어야 합니다.
플레이트를 1,000 x g 에서 10초 동안 잠시 원심분리하여 웰 측면에 붙었을 수 있는 마스터 믹스를 모아줍니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트 접착제로 웰을 밀봉한 다음 PCR 플레이트를 105°C로 설정된 가열 뚜껑과 함께 26°C로 설정된 열순환기에 넣습니다. 메모: 열순환기의 균일한 열 분포와 가열된 뚜껑은 단백질 발현 수율을 크게 향상시킵니다.
무세포 반응을 최소 3시간 동안 배양합니다. 배양 후 발현된 단백질을 정제, 정량화하여 다운스트림 공정에 사용할 수 있습니다. 메모: 발현된 단백질은 사용자가 선택한 방법을 사용하여 무세포 반응에서 직접 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 단백질은 외부 표준 곡선을 사용하여 정량화할 수 있으며, 무세포 반응에서 방사성 표지된 아미노산을 사용하는 경우 방사능을 측정할 수 있습니다. UV-가시광선 분광법 또는 총 단백질 분석은 일반적으로 초기 정제 없이 무세포 반응에서 단백질 생산을 직접 측정하는 데 권장되지 않습니다.
표 1: 10x 에너지 용액 마스터 믹스 5mL 및 4x 아미노산 마스터 믹스 2.4mL의 준비를 위한 시약.