미세유체 미세액방울 배양 시스템을 사용한 박테리아 성장의 실시간 모니터링

초록

출처: Jian, X. et. al., 미생물 미세액방울 배양 시스템(MMC)을 사용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 박테리아 성장의 실시간 모니터링을 위한 미세유체 액적 기반 플랫폼의 사용을 보여줍니다. 박테리아 현탁액을 포함하는 균일한 물방울을 생성하고 검출 경로를 통해 안내함으로써 이 시스템은 세포 밀도를 지속적으로 광학적으로 측정하여 성장 곡선을 구성할 수 있습니다.

프로토콜

1. 준비

1. 주사기 바늘(내경 0.41mm, 외경 0.71mm), 퀵 커넥터 A, 시약병(그림 1C)을 연결하고 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다.
   메모: 멸균하는 동안 시약병의 뚜껑을 약간 풉니다. 사용할 때마다 시약병 몇 개를 더 준비할 수 있습니다.
2. 0.22μm 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 필터를 사용하여 미세액방울 배양 시스템(MMC) 오일을 여과합니다. 미세유체 칩(그림 1B)과 MMC 오일을 미리 클린 벤치에 넣고 30분 동안 자외선 조사로 멸균한 후 사용하십시오.
   메모: 퀵 커넥터 A, 시약병, MMC 오일 및 미세유체 칩에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
3. 미세유체 칩 설치
   1. 수술실의 도어(그림 1A)를 열고 광섬유 프로브를 들어 올립니다.
   2. 전기장 구멍을 전기장 바늘에 맞추고 칩을 칩 받침대에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 두 개의 포지셔닝 컬럼을 포지셔닝 구멍에 삽입하고 광섬유 프로브를 내려놓습니다(그림 1D).
   3. 칩의 퀵 커넥터 A를 위치 번호(C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3)에 따라 MMC의 해당 포트에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫습니다.
4. 오일병에 MMC 오일(약 80mL까지)을 보충하고 사용하기 전에 폐기병에 있는 폐액을 비우십시오.
   메모: 폐액은 일반적으로 유기 폐기물입니다. 폐기 시 지역 법률 및 규정을 참조하시기 바랍니다.

2. MMC의 성장 곡선 측정

1. 초기 박테리아 용액 준비
   1. 관련 표준 규정에 따라 Luria-Bertani(LB) 배지를 준비하고 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다.
      메모: LB 배지의 성분: NaCl(10g/L), 효모 추출물(5g/L) 및 트립톤(10g/L).
   2. 글리세롤 스톡에서 대장균(E. coli) MG1655 균주를 꺼내 37°C의 진탕 인큐베이터(200rpm)에서 10mL의 LB 배지와 함께 50mL 쉐이크 플라스크에서 5-8시간 동안 배양합니다.
      메모: 재배 시간은 특정 균주에 따라 다릅니다. 로그 주기/단계에서 균주를 배양하는 것이 최적입니다.
   3. 배양된 대장 균 MG1655 용액을 신선한 배지로 0.05-0.1의 600나노미터(OD₆₀₀)에서 광학 밀도로 희석하여 초기 박테리아 용액(약 10mL 준비)을 얻습니다.
2. 초기화를 클릭하여 MMC를 초기화합니다. 초기화 인터페이스가 나타나면 배양 온도를 37°C로, 광전 신호 값을 0.6으로 설정합니다(그림 2A). 초기화에는 약 20분이 소요됩니다.
3. 초기화 중에 자외선(UV) 램프(파장 254nm)를 켭니다.
4. 초기 박테리아 용액과 MMC 오일을 시약 병에 주입합니다.
   1. 클린 벤치에서 멸균된 시약병을 꺼내 뚜껑을 조입니다.
   2. 10mL 멸균 주사기를 사용하여 측면 튜브의 주사기 바늘에서 3-5mL의 MMC 오일을 주입합니다. 시약병을 천천히 기울이고 회전시켜 오일이 내벽에 완전히 침투하도록 합니다.
   3. 초기 박테리아 용액 약 5mL를 주입한 후 오일 5-7mL를 다시 주입하여 시약병을 채웁니다.
   4. 독립적인 퀵 커넥터 A를 당겨 빼내고 시약 병의 퀵 커넥터 A를 퀵 커넥터 B에 삽입하여 샘플 주입 작업을 완료합니다(그림 3A).
5. 초기화가 끝날 때까지 기다린 다음 UV 램프(파장 254nm)를 끕니다.
6. 수술실의 문을 열고 시약병을 금속 수조에 넣습니다.
7. 칩의 C2 커넥터와 시약병의 퀵 커넥터 A를 당겨 빼냅니다. 시약 병의 측면 튜브 커넥터를 C2 커넥터에 연결하고 상단 튜브 커넥터를 O2 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫습니다.
8. 성장 곡선을 클릭하여 성장 곡선 측정 기능을 선택합니다(그림 2A). 매개변수 설정 인터페이스에서 숫자를 15로 입력하고 OD 감지 스위치를 켜고 파장을 600nm로 설정합니다. 시작을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다. 소요 시간은 약 10분입니다. 메모: 여기서 숫자는 생성될 물방울의 수를 나타냅니다. 파장은 감지할 OD의 파장을 나타냅니다. 실험 요구 사항에 따라 수(최대 200)와 파장(350-800nm)을 설정합니다.
9. 메인 인터페이스에 "C2와 O2 사이의 시약병을 제거한 다음 완료 후 확인 버튼을 클릭하십시오"라는 팝업 창이 나타나면 수술실 문을 열어 시약병을 꺼내고 C2 및 O2 커넥터를 연결합니다.
10. 문을 닫고 OK 팝업 창에서 버튼을 누르면 물방울이 자동으로 배양되고 OD 값을 감지할 수 있습니다.
    메모: MMC는 액적이 광섬유 프로브를 통과할 때 OD 값을 감지합니다. 따라서 감지 기간은 생성된 물방울의 수에 따라 다릅니다.
11. 성장 곡선이 정지 단계에 도달하면 데이터 내보내기 버튼을 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. 데이터 저장 경로를 선택하고 재배 기간 동안 기록된 OD 값을 적절한 소프트웨어(예: Microsoft Excel)에서 열 수 있는 .csv 형식으로 내보냅니다. 그런 다음 매핑 소프트웨어(예: EXCEL 및 Origin 9.0)를 사용하여 성장 곡선을 그립니다.
    메모: 재배 과정에서 언제든지 데이터 내보내기 를 클릭하여 현재 모든 물방울의 OD 데이터를 내보낼 수 있습니다.

결과

그림 1: MMC의 구조 및 필수 도구. (A) MMC의 외부 및 작동 챔버. (B) MMC의 미세유체 칩. 칩에는 7개의 채널(C1-C6 및 CF)이 있습니다. (C) 시약병. 탑 튜브와 사이드 튜브가 있습니다. 시약병에 샘플을 주입하기 전에 먼저 퀵 커넥터 A에 주사기 바늘을 부착한 다음 퀵 커넥터 A를 사이드 튜브에 연결하십시오. (D) 미세유체 칩의 설치. 미세유체 칩은 받침대에 설치됩니다. 그런 다음 7개의 채널(C1-C6 및 CF)이 각각 M...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 μm PVDF 필터 멤브레인	머크 밀리포어 주식회사	SLGPR33RB	MMC 오일 살균
4°C 냉장고	하이얼	BCD-289BSW	시약 보관용
한천	벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니	214010	고체 플레이트 준비용
클린 벤치	베이징 Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-인도	무균 작동 및 UV 살균용
컴퓨터	레노버	E450	소프트웨어 설치 및 MMC 제어
항온 인큐베이터	상하이 qixin 과학 기기 co., 주식 회사	LRH 250	고체 배지를 이용한 미생물 배양용
전자 저울	오하우스	아르 3130	시약 계량용
EP 튜브	써모 피셔	1.5 밀리리터	물방울 수집용
냉동 튜브	써모 피셔	2.0 밀리그램	균주 보존을 위해
글리세롤	일반 시약	G66258A	균주 보존을 위해
고압 증기 살균 냄비	산요일렉트릭	MLS3020	고압멸균 멸균용
미생물 미세액적 배양 시스템(MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	성장 곡선 결정 및 적응 진화를 수행합니다. http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 참조하십시오
미세유체 칩	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	다양한 물방울 작업용. http://www.tmaxtree.com/en/ 참조하십시오
MMC 오일	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	액적 미세유체학을 위한 유상. http://www.tmaxtree.com/en/ 참조하십시오
나크롬	일반 시약	G81793J	LB 매체의 구성 요소
페트리 접시	코닝 주식회사	90 밀리미터	고체 배지 제조용
피펫	에펜도르프	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	액체 취급용
퀵 커넥터 A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	각 조인트의 연결을 위해. http://www.tmaxtree.com/en/ 참조하십시오
시약병	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	박테리아 용액 및 시약의 샘플링 및 보관. http://www.tmaxtree.com/en/ 참조하십시오
쉐이크 플라스크	유니온-바이오텍	50 밀리리터	미생물 배양용
쉐이킹 인큐베이터	상하이 수쿤 산업 Co., Ltd.	스카이-210 2B	쉐이크 플라스크에서 미생물 배양을 위해
주사기	장쑤성 ZHIYU 의료 교육 유한 회사	10 밀리리터	액체를 끌어와 시약병에 주입합니다.
주사기 바늘	OUBEL 철물점	22G	내경은 0.41mm이고 외경은 0.71mm입니다.
트립톤	옥소이드 주식회사	LP0042	LB 매체의 구성 요소
초저온 냉장고	산요 초저	MDF-U4086S	균주 보존용(-80°C)
UV-Vis 분광 광도계	제너럴 일렉트릭 컴퍼니	울트로스펙 3100 프로	OD 값 측정용
효모 추출물	옥소이드 주식회사	LP0021	LB 매체의 구성 요소