필라멘트 시아노박테리움 Phormidium lacuna의 자연 변형 및 GFP 발현

초록

출처: Weber, N., et al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 상동 재조합을 통해 안정적인 GFP 발현 및 항생제 내성을 달성하기 위해 플라스미드 DNA를 사용하여 사상형 시아노박테리아에서 자연 형질전환을 수행하는 절차를 설명합니다.

프로토콜

1. 자연 변형 및 GFP 발현

메모: 형질전환은 대장균(E. coli)에서 전파된 플라스미드 벡터를 기반으로 합니다. pGEM-T 또는 pUC19를 백본 벡터로 사용할 수 있습니다. 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 발현을 위한 벡터의 예는 대표적인 결과 섹션에 설명되어 있습니다.

1. 멸균 실험실 조건(클린 벤치, 멸균 유리 제품)에서 멸균 재료를 사용하여 모든 단계를 수행합니다.
2. 2개의 250mL 플라스크에 2 x 50mL의 f/2 액체 배지에 2 x 1mL의 Phormidium lacuna (P. lacuna) 필라멘트를 투여합니다. 25°C에서 ~5일 동안 교반(수평 회전, 50rpm)하에 백색광(50μmol ^{m-2 s-1})에서 배양합니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 midi 준비 키트를 사용하여 ~200 μg의 형질전환 벡터 DNA를 준비합니다.
4. 100mL의 P. lacuna 세포 현탁액( 재료 표 참조)을 10,000rpm에서 3분 동안 균질화합니다. 750nm에서 OD를 측정합니다(원하는 값 = 0.35).

결과

그림 1.형 질 전환 후 5주 후 Phormidium lacuna 필라멘트. sfGFP 발현 벡터 pMH1을 사용하였다. 선택은 120μg/mL 카나마이신이 포함된 f/2 배지에서 발생했습니다. 녹색을 띤 필라멘트는 저항력이 있고 살아 있습니다. 다른 필라멘트는 죽었습니다. 스케일 바 = 100 μm

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박토 한천	오토노르발트	214010
형광현미경 ApoTome	자이스
형광 현미경 Axio Imager 2	자이스
카나마이신	시그마-알드리치	25389-94-0
현미경 DM750	자이스
Midi prep 플라스미드 추출 키트 NucleoBond Xtra Midi 키트	Macherey-NAGEL GmbH &; Co. KG	REF740410.50
광원, 형광등 L18W/954 일광	오스람		시아노박테리아의 배양
광원, LED 패널 XL 6500K 140W	블룸 스타	해당 사항 없음	시아노박테리아의 배양
페트리 접시 폴리스티롤, 100mm x 20mm	머 크	P5606-400EA
페트리 접시 폴리스티롤, 60mm x 15mm	머 크	P5481-500EA
피펫맨 100-1,000 μL	길슨	SKU : FA10006M
피펫맨 10-100 μL	길슨	참조 : FA10004M
플라스틱 피펫 10 mL, 멸균	그라이너	607107
셰이커 유니맥스 2010	하이돌프 인스트루먼트		재배용
플라스틱 튜브, 멸균, 50mL	그라이너	227261
Ultraturrax 사일런트 크러셔 M	하이돌프 인스트루먼트		균질 화기
F/2+ 액체 매체	f/2-배지, NaNO₃ 및 NaH₂PO₄ 10배 증가(0.88 mM NaNO₃, 36 μM NaH₂PO₄
F/2+-한천	박토한천 3%(w/v), 인공해수, 0.1%(v/v) 미량원소 용액, 0.05%(v/v) 비타민 용액, 8.8mM NaNO₃, 0.36mM NaH₂PO₄