필라멘트 시아노박테리움 Phormidium lacuna의 자연 변형 및 GFP 발현

초록

출처: Weber, N., et al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 상동 재조합을 통해 안정적인 GFP 발현 및 항생제 내성을 달성하기 위해 플라스미드 DNA를 사용하여 사상형 시아노박테리아에서 자연 형질전환을 수행하는 절차를 설명합니다.

프로토콜

1. 자연 변형 및 GFP 발현

메모: 형질전환은 대장균(E. coli)에서 전파된 플라스미드 벡터를 기반으로 합니다. pGEM-T 또는 pUC19를 백본 벡터로 사용할 수 있습니다. 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 발현을 위한 벡터의 예는 대표적인 결과 섹션에 설명되어 있습니다.

1. 멸균 실험실 조건(클린 벤치, 멸균 유리 제품)에서 멸균 재료를 사용하여 모든 단계를 수행합니다.
2. 2개의 250mL 플라스크에 2 x 50mL의 f/2 액체 배지에 2 x 1mL의 Phormidium lacuna (P. lacuna) 필라멘트를 투여합니다. 25°C에서 ~5일 동안 교반(수평 회전, 50rpm)하에 백색광(50μmol ^{m-2 s-1})에서 배양합니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 midi 준비 키트를 사용하여 ~200 μg의 형질전환 벡터 DNA를 준비합니다.
4. 100mL의 P. lacuna 세포 현탁액( 재료 표 참조)을 10,000rpm에서 3분 동안 균질화합니다. 750nm에서 OD를 측정합니다(원하는 값 = 0.35).
5. 세포 현탁액을 6,000 × g에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 나머지 액체와 추가 f/2⁺ 배지의 800μL(잔류 액체 및 필라멘트를 포함한 총 부피)에 펠릿을 현탁시킵니다.
6. 120μg/mL 카나마이신을 함유한 f/2⁺ 박토한천 플레이트(직경 10cm) 8개를 취합니다. 각 한천 플레이트의 중앙에 10μg의 DNA를 피펫팅합니다. 즉시 100μL의 세포 현탁액을 각 한천 플레이트의 중앙(DNA 상단)에 피펫팅합니다.
7. 과도한 액체가 증발할 수 있도록 뚜껑 없이 한천 플레이트를 클린 벤치에 보관하십시오. 접시를 닫고 25°C의 백색광에서 2일 동안 배양합니다.
8. 접종 루프가 있는 각 한천 플레이트의 필라멘트를 120μg/mL 카나마이신을 포함하는 여러 개의 신선한 f/2⁺ 박토-한천 플레이트에 분배합니다. 플레이트를 25°C의 백색광에서 배양하고 현미경으로 배양액을 정기적으로 확인합니다.
9. 현미경으로 7-28일 후에 살아 있고 변형된 필라멘트를 식별합니다. 다른 필라멘트와 다른 건강한 녹색 필라멘트 (그림 1) 를 찾으십시오. 이러한 녹색 필라멘트를 식별할 수 있으면 다음 단계를 계속하십시오. 그렇지 않으면 접시를 7일 더 보관하십시오.
10. 겸자를 사용하여 이러한 식별된 살아있는 필라멘트를 250μg/mL 카나마이신이 포함된 50mL의 액체 f/2⁺ 배지로 옮깁니다. 셰이커에서 25°C의 백색광에서 배양합니다(수평 회전, 50rpm). 최대 4주 동안 성장을 관찰합니다.
11. 필라멘트를 250μg/mL 카나마이신이 포함된 한천 배지로 다시 옮기고 필라멘트가 자랄 때까지 기다립니다. 며칠 후, 단일 필라멘트를 더 높은 농도의 카나마이신(예: 500μg/mL)이 있는 신선한 한천 플레이트로 옮깁니다. 원래 플레이트를 보관하십시오.
12. 필라멘트가 액체 배양 또는 한천에서 고농도의 카나마이신으로 증식되는지 확인하십시오. 분리 속도를 높이기 위해 카나마이신 농도를 다시 높입니다. 메모: 형질전환된 P. lacuna 는 최대 10,000μg/mL의 카나마이신에서 자랍니다. 다른 종은 그러한 높은 농도를 견디지 못할 수도 있습니다.
13. GFP 발현의 경우: 40x 또는 63x로 설정된 대물렌즈의 배율에서 형광 현미경으로 단일 필라멘트를 관찰합니다. 명시야 투과 이미지와 형광 이미지를 캡처합니다. GFP에 대해 여기용 470nm 대역 통과, 방출용 525nm 대역 통과, 495nm 빔 스플리터, 초기 노출 시간 500ms의 설정을 사용합니다.
14. 포화 강도를 피하면서 선명한 형광 신호를 위해 노출 시간을 조정하십시오. 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 사용해 보십시오.
15. 야생형 필라멘트도 형광을 표시하므로 이 배경 형광에 대해 위와 동일한 설정으로 이미지를 캡처합니다. 참고: GFP를 발현하는 균주는 더 높은 신호를 가져야 합니다. 그렇지 않으면 GFP를 표현하지 않습니다.
16. 노출 시간과 형광 이미지의 픽셀 강도를 기반으로 다양한 필라멘트의 GFP 함량을 계산하고 비교합니다.

결과

그림 1.형 질 전환 후 5주 후 Phormidium lacuna 필라멘트. sfGFP 발현 벡터 pMH1을 사용하였다. 선택은 120μg/mL 카나마이신이 포함된 f/2 배지에서 발생했습니다. 녹색을 띤 필라멘트는 저항력이 있고 살아 있습니다. 다른 필라멘트는 죽었습니다. 스케일 바 = 100 μm

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박토 한천	오토노르발트	214010
형광현미경 ApoTome	자이스
형광 현미경 Axio Imager 2	자이스
카나마이신	시그마-알드리치	25389-94-0
현미경 DM750	자이스
Midi prep 플라스미드 추출 키트 NucleoBond Xtra Midi 키트	Macherey-NAGEL GmbH &; Co. KG	REF740410.50
광원, 형광등 L18W/954 일광	오스람		시아노박테리아의 배양
광원, LED 패널 XL 6500K 140W	블룸 스타	해당 사항 없음	시아노박테리아의 배양
페트리 접시 폴리스티롤, 100mm x 20mm	머 크	P5606-400EA
페트리 접시 폴리스티롤, 60mm x 15mm	머 크	P5481-500EA
피펫맨 100-1,000 μL	길슨	SKU : FA10006M
피펫맨 10-100 μL	길슨	참조 : FA10004M
플라스틱 피펫 10 mL, 멸균	그라이너	607107
셰이커 유니맥스 2010	하이돌프 인스트루먼트		재배용
플라스틱 튜브, 멸균, 50mL	그라이너	227261
Ultraturrax 사일런트 크러셔 M	하이돌프 인스트루먼트		균질 화기
F/2+ 액체 매체	f/2-배지, NaNO₃ 및 NaH₂PO₄ 10배 증가(0.88 mM NaNO₃, 36 μM NaH₂PO₄
F/2+-한천	박토한천 3%(w/v), 인공해수, 0.1%(v/v) 미량원소 용액, 0.05%(v/v) 비타민 용액, 8.8mM NaNO₃, 0.36mM NaH₂PO₄