이 비디오는 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이를 생성하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 시아노박테리아 배양으로 시작하여 표면 필리를 보존하는 원심분리 및 세척 단계가 이어집니다. 그런 다음 상동 서열 옆에 있는 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드를 도입합니다. 배양하는 동안 플라스미드는 필리를 통해 내재화되고 상동 재조합을 통해 표적 유전자를 대체합니다. 항생제 선택 및 재추출은 돌연변이 균주를 분리하고 정제하는 데 사용됩니다.
프로토콜
배양 배지 준비
Castenholz(1988)에 따라 청록색 배지 11(BG11 배지)을 준비합니다.
100x BG11, 미량 원소 및 철 스톡의 원액을 준비합니다(표 1).
인산염 스톡, 탄산나트륨(Na₂CO₃) 스톡, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산(TES) 완충액 및 중탄산나트륨(NaHCO₃)의 개별 용액을 준비합니다(표 1).
인산염 및 Na₂CO₃ 스톡을 오토클레이브합니다. 0.2 μm 필터로 TES 완충액 및 NaHCO₃를 필터 멸균합니다.
물 976ml, 100x BG11 10ml, 미량 원소 1ml, 철 스톡 1ml를 혼합하여 BG11을 제조하고 용액을 오토클레이브합니다. 이 용액이 실온으로 냉각된 후 인산염 스톡 1ml, Na₂CO₃ 스톡 1ml 및 NaHCO₃ 10ml를 추가합니다.
BG11 고체 배지의 경우 한천 15g과 물 700ml를 플라스크 1개에 넣습니다. 두 번째 플라스크에 티오황산나트륨(Na₂S₂O₃) 3g, 물 226ml, 100x BG11 10ml, 미량 원소 1ml, 철분 1ml를 첨가합니다. 두 솔루션을 모두 오토클레이브합니다. 이 용액이 실온으로 냉각된 후 결합하고 인산염 스톡 1ml, Na₂CO₃ 스톡 1ml, TES 완충액 10ml 및 NaHCO₃ 10ml를 첨가합니다. 메모: 용액은 특정 염의 침전을 방지하기 위해 별도로 준비됩니다.
Synechococcus의 배양을 위해, 10 ml의 1 M 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES) 및 1ml의 비타민 B12(표 1)를 1 L의 BG11 배지에 첨가한다. 메모: 상업적으로 이용 가능한 BG11 배지에서 배양된 균주의 형질전환은 여기에 설명된 BG11 배지 레시피보다 현저히 덜 효율적이므로 권장되지 않습니다.
표 1: 이 연구에 사용된 솔루션.
원액 레시피
화학
양(g)
100x BG11(L당)
나노₃
149.6
MgSO₄·7H₂O
7.49
CaCl₂·2H₂O
3.6
구연산
0.6
0.25 M Na₂EDTA 1.12 ml, pH 8.0 첨가
0.25 M Na₂EDTA, pH 8.0 (100 ml 당)
Na₂EDTA
9.3
미량 원소(100ml당)
H₃BO₃
0.286
MnCl₂·4H₂O
0.181
ZnSO₄·7H₂O
0.022
Na₂MoO₄·2H₂O
0.039
CuSO₄·5H₂O
0.008
Co(NO₃)₂·6H₂O
0.005
철분 스톡(100ml당)
구연산철 암모늄
1.11
인산염 스톡(100ml당)
K₂HPO₄
3.05
Na2CO3 스톡(100 ml당)
Na₂CO₃
2
TES 완충액, pH 8.2(100ml당)
오 셨
22.9
NaHCO3 스톡 (100ml 당)
NaHCO₃
8.4
HEPES, pH 8.2 (500ml당)
헴스
119.15
비타민 B₁₂ (50ml당)
시아노코발라민
0.02
루리아 베르타니 미디어 (500ml 당)
루리아 베르타니 국물
12.5
1 M MgCl₂ (100 ml 당)
MgCl₂·6H₂O
20.33
용액 A(200ml당)
MnCl₂·4H₂O
0.395
CaCl₂·2H₂O
1.47
2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 수화물, 4-모르폴린에탄술폰산(MES)
0.4265
용액 A + 글리세롤
용액 A 10ml
글리세롤 1.5ml
2. 시아노박테리아 균주의 성장
최대 부피가 50ml인 100ml 원추형 플라스크에 균주를 넣고 분당 120회전(rpm)으로 흔듭니다. BG11 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 플레이트 측면에 세 개의 작은 구멍을 뚫어 가스 교환을 허용합니다. 20-40μmol 광자 m-2 sec-1 사이의 광도로 광생물반응기의 형광등 아래에서 30°C에서 모든 균주를 배양합니다.
최고의 멸균 기술을 사용하십시오. 층류 후드에서 모든 시아노박테리아 균주를 처리합니다. 메모: 이는 쉽게 오염될 수 있는 자당을 함유한 배지로 균주를 배양할 때 특히 중요합니다.
3. 플라스미드 구조체의 생성
Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)와 같은 프라이머 설계 소프트웨어를 사용하여 필요한 제한 효소 부위를 포함한 프라이머 세트를 설계하여 관심 유전자의 2~1kb 영역 5' 및 3'을 증폭합니다. Cyanobase(http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase)를 통해 시아노박테리아 종의 게놈 서열을 참조하십시오. 여기에 사용된 모든 프라이머에 대해서는 표 2 를 참조하십시오. 프라이머를 설계할 때 다음 요소를 고려하십시오.
증폭된 영역에 돌연변이될 유전자의 5' 및 3' 영역이 포함되어 있는지 확인하십시오 .그림 1.
안티센스 및 비코딩 RNA의 의도하지 않은 돌연변이를 방지하기 위해 유전자간 영역을 돌연변이시키지 마십시오.
측면 영역을 선택할 때 대 장균 에서 이러한 유전자의 발현이 복제를 방해할 수 있으므로 인접한 유전자의 전체 개방형 판독 프레임을 포함하지 마십시오.
제조업체의 지침에 따라 충실도가 높은 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 제품을 증폭합니다. 메모: 우리의 경험에 따르면 이 효소는 오류가 거의 없습니다.
고충실도 완충액(HF 완충액)과 0, 1.5 또는 3μl의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하는 50μl PCR 반응을 설정합니다. 반응당 100ng의 게놈 DNA를 사용합니다. 98°C에서 30초 동안 초기 변성 단계, 10초 동안 98°C에서 35회, 67°C에서 30초, 72°C에서 30초, 72°C에서 5분 동안 최종 확장 단계로 구성된 프로그램을 사용합니다. 이것은 일반적으로 일관된 제품을 제공합니다.
겔 전기영동을 통해 엔도뉴클레아제 효소로 분해된 PCR 산물 및 샘플의 크기가 올바른지 확인합니다. 0.02%(v/v) 에티듐 브로마이드를 함유한 1%(w/v) 아가로스 겔을 100V에서 45분 동안 실행합니다. 주의: 에티듐 브로마이드는 잠재적인 돌연변이 유발 물질이므로 적절한 보호 기능을 가지고 취급해야 합니다.
제조업체의 지침에 따라 DNA 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 또한 이 키트를 사용하여 아가로스 겔에서 절단된 조각을 포함하여 플라스미드 단편을 정제합니다. 정제된 DNA를 물 14μl에 용리합니다.
클로닝 단계의 경우, 제조업체의 지침에 따라 제한 엔도뉴클레아제 반응 혼합물을 37°C에서 총 부피 30μl로 >1시간 동안 배양합니다.
결찰 단계의 경우, 정제된 소화된 플라스미드 5μl, 정제된 소화된 인서트 12μl, 완충액 2μl, 리가제 1μl를 포함하는 총 부피 20μl의 실온에서 DNA 단편을 >1시간 동안 결찰합니다.
다음 방법에 따라 대장균 DH5α 형질전환 세포를 준비합니다.
10ml Luria Bertani(LB) 배지에서 하룻밤 동안 대장균 배양을 배웁니다.
6ml 1 M MgCl2 (표 1)를 포함하는 1 L 원뿔형 플라스크에 400 ml LB를 1 ml의 하룻밤 배양액과 함께 접종합니다.
배양액을 37°C에서 220rpm에서 약 4시간 동안 또는 OD₆₀₀nm가 0.4-0.6에 도달할 때까지 배양합니다.
세포를 얼음 위에 1시간 동안 놓습니다.
2,800 × g에서 10분 동안 원심분리하여 4°C에서 펠릿 세포를 만듭니다.
상청액을 제거하고 160ml 용액 A(표 1)에 재현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
2,800 × g에서 10분 동안 원심분리하여 4°C에서 펠릿 세포를 만듭니다.
상청액을 제거하고 4ml 용액 A + 글리세롤에 재현탁합니다(표 1).
50μl 분취량을 준비하고 액체 N2에 동결하고 -80°C에서 보관합니다.
결찰 혼합물 5μl와 유능한 세포 50μl를 혼합하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.
세포를 42°C에서 90초 동안 열 충격 한 다음 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다.
950μl의 LB 배지(표 1)를 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
암피실린(100μg/ml) 및/또는 카나마이신(30μg/ml)과 같은 적절한 항생제와 함께 플레이트에 50 및 200μl를 분취합니다. 주의: 카나마이신과 암피실린은 모두 독성이 있으므로 적절한 보호 기능을 가지고 취급해야 합니다.
적절한 항생제를 접종한 2ml LB 배지에서 단일 콜로니를 선택하고 배양합니다.
제조업체의 지침에 따라 miniprep 플라스미드 정제 키트를 사용하여 모든 플라스미드를 정제합니다.
다음 단계에 따라 cpcC1C2 유전자를 녹아웃하기 위해 이 특정 예에서 플라스미드를 생성합니다.
프라이머 cpcC1C2leftfor 및 cpcC1C2leftrev를 사용하여 1,012 염기쌍(bp) 5' 측면 영역(왼쪽 단편)을 증폭합니다(단계 3.2, 표 2 참조). 소량의 PCR 반응을 제거하고 겔 전기영동을 통해 올바른 크기의 산물이 증폭되었는지 확인합니다(단계 3.3). 이 단편과 pUC19를 XbaI 및 BamHI로 분해합니다(3.5단계).
두 제제를 정제하고(3.4단계), 결찰하고(3.6단계), 형질전환(3.7단계), 미니프렙을 통한 플라스미드 정제를 위해 별도의 콜로니에서 암피실린(100μg/ml)으로 4개의 2ml LB 액체 배양물을 설정합니다(3.8단계).
XbaI/BamHI 분해 및 겔 전기영동을 통해 단편이 pUC19에 삽입되었는지 확인합니다(단계 3.3). 2,660 bp 및 1,012 bp의 밴드는 플라스미드에 삽입물이 올바르게 도입되었음을 나타냅니다.
프라이머 cpcC1C2rightfor 및 cpcC1C2rightrev를 사용하여 1,016bp 3' 측면 영역(오른쪽 단편)을 증폭합니다(단계 3.2, 표 2 참조). 소량의 PCR 반응을 제거하고 겔 전기영동을 통해 올바른 크기의 산물이 증폭되었는지 확인합니다(단계 3.3). 이 단편과 pUC19를 SacI 및 EcoRI로 분해합니다(3.5단계).
두 제제를 정제하고(3.4단계), 결찰하고(3.6단계), 형질전환(3.7단계), 미니프렙을 통한 플라스미드 정제를 위해 별도의 콜로니에서 암피실린(100μg/ml)으로 4개의 2ml LB 액체 배양물을 설정합니다(3.8단계).
SacI/EcoRI 분해(단계 3.5) 및 겔 전기영동(단계 3.3)을 통해 단편이 pUC19에 삽입되었는지 확인합니다. 2,660 bp 및 1,016 bp의 밴드는 플라스미드에 삽입물이 올바르게 도입되었음을 나타냅니다. 참고: 5' 영역의 복제를 위한 XbaI/BamHI 사이트와 3' 영역을 pUC19로 복제하기 위한 SacI/EcoRI는 가능한 한 사용됩니다. 가능한 경우 항상 5' 영역의 역방향 프라이머 또는 3' 영역의 순방향 프라이머에 BamHI 사이트를 포함하여 이후 복제 단계를 더 쉽게 수행할 수 있도록 합니다.
삽입 부위에 걸쳐 있는 프라이머( 예 : M13 정방향 및 M13 역방향)를 사용하여 서열이 올바른지 확인하기 위해 두 삽입물을 시퀀싱합니다(표 2). 측면 영역에 오류가 발생하지 않도록 순서가 정확해야 합니다.
XbaI/BamHI 분해를 통해 pUC19에서 왼쪽 단편을 절제합니다. xbaI/BamHI로 pUC19 + 오른쪽 단편을 분해합니다(3.5단계).
메스 칼날을 사용하여 DNA를 절제하여 아가로스 겔(단계 3.3)에서 1,012 bp 왼쪽 단편과 3,676 bp pUC19 + 오른쪽 단편을 정제합니다.
두 제제를 모두 정제하고(3.4단계), 결찰하고(3.6단계), 형질전환하고(3.7단계) 미니프렙을 통한 플라스미드 정제를 위해 별도의 콜로니에서 암피실린(100μg/ml)으로 4개의 2ml LB 액체 배양물을 설정합니다(3.8단계).
XbaI/BamHI 분해(3.5단계) 및 겔 전기영동(3.3단계)을 통해 pUC19 + 오른쪽 단편에 단편이 삽입되었는지 확인합니다. 3,676 bp 및 1,012 bp의 밴드는 인서트가 플라스미드에 올바르게 삽입되었음을 나타냅니다(이를 플라스미드 B라고 함).
BamHI 분해를 통해 pUM24cm19에서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제/레반수크라제 유전자(npt1/sacB) 카세트를 절제합니다. BamHI로 플라스미드 B를 분해합니다(3.5단계). 메모:npt1/sacB 카세트는 pUM24cm가 클로람페니콜 내성을 부여하는 단백질을 암호화하기 때문에 아가로스 겔에서 정제할 필요가 없습니다. 따라서 콜로니가 LB/암피실린/카나마이신 한천 플레이트에서 성장하는 경우, 내성 콜로니로 이어질 수 있는 유일한 조합은 npt1/sacB 카세트를 플라스미드 B에 통합하는 것입니다.
두 제제를 정제하고(단계 3.4), 결찰하고(단계 3.6), 형질전환하고(단계 3.7), 미니프립을 통한 플라스미드 정제를 위해 별도의 콜로니에서 암피실린(100μg/ml) 및 카나마이신(30μg/ml)으로 4개의 2ml LB 액체 배양물을 설정합니다(단계 3.8).
BamHI 분해(단계 3.5) 및 겔 전기영동(단계 3.3)을 통해 npt1/sacB 카세트가 플라스미드 B에 삽입되었는지 확인합니다. 4,688 bp 및 3,894 bp의 밴드는 삽입물이 플라스미드에 올바르게 삽입되었음을 나타냅니다(이를 플라스미드 A라고 함).
표 2 : 이 연구에 사용된 프라이머. 제한 엔도뉴클레아제 부위에 밑줄이 그어져 있습니다.
입문서
순서
cpcC1C2left를
GTACTCTAGAGCGGCTAAATGCTACGAC
cpcC1C2leftrev
GATCGGATCCGCGGTAATTGTTCCCTTTGA
cpcC1C2right에 대한
GATCGAGCTCTGCACTGGTCAGTCGTTC
cpcC1C2rightrev
GACTGAATTCATCGTTGCTTGAACGGTCTC
M13 전방
TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 리버스
CAGGAAACAGCTATGAC
cpcC1C2의 경우
GTTTTCATTGGCATCGGTCT
cpcC1C2rev
ATGTCCCAGGAACGACTGAC
A1173의 경우
AGCAAACCGTTTTTGTGACC
A1173개정
TGCAAGGTGGCGAACTGTAT
4. 현저한 시네코시스티스 및 시네코코커스 돌연변이체의 생성
세포로 가득 찬 루프를 30-50ml의 BG11 배지에 접종하여 신선한 배양을 설정합니다. 750나노미터 또는 OD₇₅₀nm = 0.2 내지 0.6의 광학 밀도로 2-3일 동안 배양물을 성장시킵니다. 메모: 일반적으로 개별 콜로니는 접종에 사용하기에는 너무 작으며, 개별 세포를 낮은 수준의 빛에 노출시키면 광억제 및 내광성 돌연변이체에 대한 선택이 발생합니다.
배양액 1-2ml를 2,300× g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 시아노박테리아 배양물을 >2,300 × g으로 원심분리하면 세포가 손상될 수 있으므로 원심분리하지 마십시오. BG11 배지로 펠릿을 한 번 세척합니다. 메모: 소용돌이로 세포를 재현탁하면 DNA 흡수에 필수적인 필리가 손실될 수 있으므로 세포를 재현탁하지 마십시오. 부드러운 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다.
BG11 배지를 최종 부피 100μl에 첨가합니다. 세포를 14ml 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
1μg의 플라스미드 A를 세포에 첨가하고 부드럽게 두드려 혼합합니다. <10μl의 플라스미드를 첨가합니다. 메모: 바람직하게는, 플라스미드는 >100 ng/μl의 농도여야 하지만, 이보다 낮은 농도는 성공적인 형질전환에 적합하다.
인큐베이터에 튜브를 수평으로 눕힙니다. 배양액을 4-6시간 동안 배양합니다. 메모: 세포는 1-2시간마다 두드려 잠시 혼합할 수 있지만 필수는 아닙니다. 샘플을 진탕 인큐베이터에 넣을 수 있지만 효율성이 크게 향상되지는 않습니다.
항생제 없이 BG11 한천 플레이트에 세포 배양/플라스미드 DNA 혼합물의 분취량을 퍼뜨립니다. 일반적으로 20μl와 80μl의 분취량을 별도의 플레이트에 퍼뜨립니다.
~24시간 후, 카나마이신을 함유한 물에 0.6% 한천 용액 2.5-3ml를 한천 플레이트에 첨가합니다(20ml당: 한천 0.12g, 100mg/ml 카나마이신 100μl). 이 용액을 ~42°C로 냉각하고 한천 플레이트의 가장자리에 첨가합니다. 용액이 표면에 균일한 '상단 한천' 층을 형성하도록 플레이트를 기울입니다.
한천 플레이트를 더 오랜 시간 동안 배양합니다. 콜로니는 약 7일 후에 보여야 합니다. 메모: 한천 플레이트는 인큐베이터에 3 높이로 쌓을 수 있습니다. 일반적으로 변환당 수백 개의 콜로니가 얻습니다.
BG11 + 카나마이신(30μg/ml) 한천 플레이트에 개별 콜로니를 줄무늬로 만듭니다. 한천 플레이트를 6개의 섹터로 나누고 끝이 뭉툭한 이쑤시개를 사용하여 각 섹터에 식민지를 줄무늬로 그립니다. 단일 식민지를 얻는 것은 중요하지 않습니다. 트랜스포메이션의 성장만이 그렇습니다.
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결과
그림 1: Synechocystis에서 표시 및 표시되지 않은 녹아웃(예: cpcC1 및 cpcC2)의 생성을 위한 플라스미드 구성. (...
