미생물-벌레 상호작용을 연구하기 위한 고처리량 형광 분석법

초록

출처: 알리, I. 외. 세골부리아티 스 엘레간 스 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝. J. Vis. 경험 (2022)

이 영상은 장내 세균이 Caenorhabditis elegans 에서 스트레스 회복력에 미치는 영향을 평가하는 고처리량 형광 검사를 시연합니다. 파열된 장 과립에서 나오는 청색 형광을 추적함으로써, 검사 박테리아에 노출된 벌레의 초기 사망 신호를 밝혀냅니다.

프로토콜

1. 라벨 없는 Caenorhabditis elegans(C. elegans) 생존 점수 측정(LFASS), 열충격 및 산화 분석 설정 (13일차 - 14일차)

1. 벌레의 발달 단계를 평가하세요. >90%의 벌레가 L4에 도달하면, 최대 10mL의 멸균 M9 용액에 15mL 원뿔관에 채취하세요.
2. 벌레를 4°C에서 142g 용액으로 2분간 2분간 세척한 뒤, 상원액을 제거하고, 각 세척 사이에 신선한 멸균 M9 10mL를 추가하여 대장균 OP50 박테리아를 제거하세요. 벌레 펠릿을 10mL의 M9에 재현탁하세요.
3. 50 μL 벌레 용액을 950 μL M9가 들어 있는 저표면 결합관에 옮깁니다. 튜브 내용물을 부드럽게 섞어 벌레 침전을 방지한 후, 젖은 저결합 피펫 팁을 사용해 3-4개의 각각 10 μL 방울을 유리 슬라이드 또는 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에 빠르게 옮깁니다. 입체현미경으로 16배 확대로 벌레 수를 세어보세요. 3-4방울 수치를 평균 내어 벌레 용액 내 마이크로리터당 벌레 수를 계산하세요.
4. 10 mL 튜브 내 벌레 농도를 8 μL에 ~120 구충 상태로 조절합니다. 만약 1.2단계에서 준비된 해답이라면, 농도가 충분하지 않으면 웜을 스핀다운하고 M9를 제거하여 8 μL당 120개의 웜을 달성합니다.
5. 다채널 피펫 또는 반복 피펫을 사용해 미리 준비된 8개의 96웰 NGM-아가로스 플레이트의 각 웰에 8μL의 웜 용액(~120 웜)을 이송합니다. 지렁이 손실을 최소화하기 위해 저저 보존 팁을 사용하세요. 또한 성충에 가해지는 기계적 스트레스를 줄이기 위해 큰 성충이 들어갈 수 있도록 끝부분을 잘라야 할 수도 있습니다.
   메모: 이 분석은 최소 30마리의 건강한 벌레가 필요하며, 유정당 약 100마리의 벌레가 가장 효과적입니다.
6. 벌레와 박테리아 씨앗을 채운 96웰 NGM-아가로스 플레이트를 25°C에서 36시간 배양합니다.
7. 12시간에서 24시간 사이에 판을 점검하여 벌레가 계속 채워져 있는지 확인하세요. 재급식이 필요할 경우, 15°C에 저장된 96웰 박테리아 배열 플레이트 내에 박테리아를 다시 부유시키고, 36시간 잠복 기간 내에 굶주림 위험이 있는 96웰 NGM-아가로스 플레이트에 해당 박테리아 용액 최대 10 μL을 추가하세요(굶주린 벌레는 결과가 크게 다를 수 있습니다). 그래서 이 점이 매우 중요합니다).
   메모: 15일째에는 다음 단계를 수행해야 합니다. 분석을 시작하기 전에 읽기 높이를 최적화하는 것이 필요할 수 있습니다. 최적의 측정값은 우물 바닥에서 20-50 μm 위에서 달성됩니다. 이는 판 리더기의 모델에 따라 다릅니다. 일부는 Z-스캔 기능을 제공하고, 일부는 수동 높이 입력이 가능합니다. 최적 높이를 가장 높은 청색 형광 신호(365 nm/430 nm)로 설정하세요. 일부 플레이트 리더는 부착 세포 분석에 최적화된 고정 높이에서 작동할 수 있으며, LFASS 검사에는 적합하지 않을 수 있습니다.
8. 36시간 후, 96웰 플레이트의 각 웰에 30 μL의 M9를 투여합니다.
   메모: 열응력 분석의 경우, 판 리더기가 측정을 수행하기 위해 필요한 온도에 도달해야 하며, 사전에 전원을 켜야 할 수도 있습니다. 현재 프로토콜은 살해 속도를 극대화하기 위해 42 °C를 사용하지만, 30 °C 이상의 다른 온도에도 적용됩니다.
9. 약 20 μL의 웜을 384웰 플레이트에 배치된 레이아웃에 따라 저저 보존 팁을 사용하며(팁 끝을 잘라내어 큰 웜이 성충의 기계적 스트레스를 줄이도록 하는 것을 고려하세요).
   메모: 본 연구에서는 여기서 설명하는 두 분석법(열응력과 산화 응력)에 대해 두 가지 다른 판 리더 설정이 사용되므로, 이 두 분석법을 위한 샘플은 동일한 384웰 판에 도판되어서는 안 됩니다.
10. 플레이트 리더기가 올바르게 설치되어 있는지 확인하세요(표 1).
11. 384웰 플레이트에 M9을 더 추가하여 최종 웰당 60 μL 부피를 목표로 합니다. 열응력 분석의 경우 M9 40 μL를, 삼부틸 하이드로퍼옥사이드(t-BHP) 유도 산화 스트레스의 경우 34 μL M9를 6 μl t-BHP 안에 첨가합니다.
    1. t-BHP 첨가 후 2분 이내에 분석을 시작하세요(이상적으로는 모든 벌레를 동시에 t-BHP 노출시켜야 하며, 분석 시간 해상도는 2분입니다). 불가능하다면 분석기 시작 전에 t-BHP 피펫팅 시간을 추정하여 중위 사망 시간을 나중에 조정할 수 있도록 하세요.
12. 접시를 투명한 뚜껑으로 닫아. 384 웰 플레이트의 가장자리를 마스킹 테이프(플레이트와 뚜껑 위에 테이프로 붙이세요)로 밀봉하되, 테이프가 뚜껑 위나 플레이트 아래로 들어가지 않도록 하세요. 메스를 사용해 뚜껑과 판 사이에 테이프를 간격을 두어 공기 교환을 허용하고 증발을 최소화했습니다.
13. 플레이트를 플레이트 리더기에 넣고 작업을 시작하세요. 365nm에서 여기를 하고 435nm에서 방출을 2분마다 6-12시간 동안 탐지하는 것을 목표로 합니다(표 1).
    메모: 일반적으로 42 °C 열스트레스 분석에는 6시간, 7% t-BHP 산화 스트레스 분석에는 8시간이 필요합니다.

표 1: 산화 및 열 스트레스 분석 설정. 이 연구에서 사용한 형광판 리더기에서 산화(A) 및 열(B) 응력 분석에 사용된 설정 예시입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
384웰 검은색 투명 평평한 바닥판	코 닝	3712년 또는 3762년	빠른 스트레스 검사를 위해 반드시 멸균이 필요한 것은 아닙니다
96웰 투명판 (바이오라이트)	열	130188
아가로스	피셔 사이언티브	BP1356
LoBind 팁	VWR	732-1488	로-바인드는 이식 시 구충 손실을 줄여줍니다
로바인드 튜브	에펜도르프	22431081
플레이트 리더 - 무한 M 나노+	테칸		단색기 설치는 형광 튜닝을 가능하게 하지만, 적절한 필터 기반 설정도 사용할 수 있습니다
번호판 인식기 - 스파크	테칸
트랜스빌라이트 베이스가 있는 입체 현미경 설치	라이카	MZ6, 또는 M80	0.6-0.8배에서 최대 40-60배까지 확대가 필요하며, 변형 가능하거나 타협 가능한 미러가 있는 고품질 트랜스빌라이트 베이스가 필요합니다.
t-BHP (터트-부틸 하이드로퍼옥사이드)	시그마-올드리치	458139
Nunc 투명 접착 씰	피셔 사이언티브	101706871	투명해야 하며, 분석에 관련된 온도를 견딜 수 있어야 합니다.