재조합 박테리아 단백질 정제를 위한 친화 크로마토그래피 기법

초록

출처: Becker, B. 외 효모에서 리신 독소 A 사슬(RTA) 수송에 필요한 세포 구성 요소를 규명하기 위한 간단한 형광 기반 리포터 검사법. J. Vis. 경험 (2017).

이 영상은 니켈 기반 친화성 크로마토그래피를 이용해 폴리히스티딘 표지된 재조합 단백질을 정제하는 과정을 보여줍니다. 이 연구는 초음파 검사를 통한 박테리아 용해, 용해액의 정화 및 여과, 그리고 이미다졸을 이용한 표적 단백질의 선택적 결합 및 용출 등 주요 단계를 설명합니다.

프로토콜

1. 친화 크로마토그래피를 통한 His 태그 RTA 정제

1. 다음 프로토콜을 사용하여 얼음 위에서 세포를 초음파 처리합니다: 15초 펄스(20마이크론), 30초 정지. 이 단계를 다섯 번 반복하세요.
2. 원심분리기 셀은 21,000 x g, 4 °C에서 15분간 용해하고, 멸균 주사기 필터 시스템(0.2 μm 공극 크기)을 사용해 상원액을 여과합니다.
   메모: 성공적으로 초음파 검사를 받은 샘플의 세포 펠릿은 투명한 경계를 보입니다.
3. 5mL Ni²⁺ 기반 친화성 컬럼이 장착된 자동 정제 시스템을 사용하여 멸균 여과된 대장균 상청액에서 His 태그가 부착된 RTA 분획을 정제 합니다 . 일반적으로 분당 1mL의 용출 속도를 사용하고, 전체 정제 시스템을 냉각하여 비효율적인 독소 결합과 독소 활성 손실을 방지하세요.
   메모: 효율적인 RTA 정제를 위한 매개변수는 표 1에 나열되어 있습니다.
   1. 간단히 말해, 친화성 컬럼을 20mL의 결합 버퍼와 평형으로 맞추어 저장 버퍼를 제거합니다. 멸균 여과된 상정액을 친화성 컬럼에 주사기를 사용해 도포합니다.
   2. 25-35mL의 결합 완충액으로 컬럼을 세척하여 캡에서 분리된 단백질을 제거합니다. 280nm 거리의 자외선 흡수가 초기 자외선 값에 가까워질 때까지 세척 단계를 반복하세요.
   3. 20-35 mL의 용출 완충제(500 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7.2)에 유루트 결합 RTA 분획을 사용하고, 샘플을 얼음 위에 보관합니다(그림 1A 및 그림 1B).
      메모: RTA 분획의 용출은 자외선 흡수가 증가하는 것으로 특징지어집니다. 비특이적 결합 단백질 오염을 방지하기 위해 이 분획만 수집할 것을 유의하시기 바랍니다.

표 1: 컬럼 기반 친화성 정제 및 탈염에 사용되는 매개변수. 관련 컬럼 설정(예: 유량, 용출 완충 농도, 평형 및 세척 단계 시간)과 측정된 매개변수(예: 전도도 또는 자외선 흡수) 목록입니다.

친화력 크로마토그래피 파라미터
측정 매개변수	자외선(280nm), 용출 완충 농도, 전도도
설정	가변/단위	값
유량	mL/분	1
최대 컬럼 압력	MPa	0.35
파장	뉴	280 nm
결합 버퍼	펌프 위치	A
용출 버퍼	펌프 위치	B
시작 농도 용출 완충제	%	0
시스템 부피 보상	mL	10
컬럼 평형	mL	20
슈퍼루프/주사기를 통한 샘플 주입	mL	세포 용해액 부피
세척 단계	mL	20-35
용출 단계	mL	20-35
용출 중 농축 용출 완충제	%	100
20% EtOH로 컬럼 재보정	mL	50
탈염 매개변수
측정 매개변수	자외선 (280 nm), 전도도
설정	가변/단위	값
유량	mL/분	4
최대 컬럼 압력	MPa	0.35
파장	뉴	280 nm
결합 버퍼	펌프 위치	A
용출 버퍼	펌프 위치	B
시작 농도 용출 완충제	%	0
시스템 부피 보상	mL	10
컬럼 평형	mL	20
슈퍼루프/주사기를 통한 샘플 주입	mL	세포 용해액 부피
소금 제거 버퍼 주입 (0.8 M 소르비톨)	mL	100
20% EtOH로 컬럼 재보정	mL	50

결과

그림 1: pET-RTA_(His)6 또는 빈 벡터 대조군을 포함한 대장균 세포의 대표적인 친화 크로마토그래피 및 탈염 결과.(A) 벡터 pET24-RTA_(His)6에서 RTA_(His)6를 발현한 대장균 세포 용해물 샘플의 전형적인 정제 그래프. 파란색 곡선은 280nm 거리에서 아...

재료