셀룰로오스 생성 박테리아로부터 나노셀룰로오스 펠리클 제조

초록

출처: Arias, S. L. 외 산화철 나노입자를 이용한 기능화된 자성 박테리아 나노셀룰로오스 제조. J. Vis. 경험 (2016년).

이 영상은 만니톨이 포함된 영양 배지에서 셀룰로오스 생성 박테리아를 배양하여 나노셀룰로오스를 생산하는 과정을 시연합니다. 박테리아는 만니톨을 포도당으로 대사하고, 포도당은 중합되어 글루칸 사슬로 압출되어 셀룰로오스 시트로 결정화되어 공기-액체 계면에서 3차원 매트릭스를 형성합니다. 생성된 젤라틴성 펠리클은 수확하여 알칼리성 및 물 세척으로 정제한 후 오토클레이빙으로 멸균하여 추가 적용을 위해 사용한다.

프로토콜

1. 박테리아 나노셀룰로오스(BNC) 제제

메모: 모든 단계는 별도 언급이 없는 한 무균 상태에서 수행됩니다.

1. 배양지를 준비하세요.
   1. 효모 추출물 25g, 펩톤 15g, 만니톨 125.0g, 고순도 물 500ml를 혼합하여 500ml의 액체 배양지를 준비합니다. 이 혼합물을 120°C에서 20분간 오토클레이브한 후 4°C에서 보관합니다.
   2. 100ml의 반고체 배지를 15g의 한천과 5.0g의 효모 추출물, 3.0g의 펩톤, 25.0g의 만니톨, 100ml의 고순도수에 첨가하여 준비합니다. 이 혼합물을 120°C에서 20분간 오토클레이브합니다. 오토클레이팅 후에는 혼합물 5ml를 90mm x 16mm 플라스틱 페트리 접시에 담그세요. 용액을 4 °C에서 젤로 만들었다가 이 온도에서 보관하다가 다시 사용할 때까지 보관하세요.
2. 제조사 지침에 따라 1ml의 액체 배양지를 추가하고 피펫팅하여 동결 건조 바이알에 보존된 글루코아세토박터 자일리누스 (G. xylinus) 균주를 재수화합니다.
3. 반고체 배지를 포함한 페트리 접시에 박테리아 현탁액의 작은 방울을 접종 루프를 사용해 접종합니다. 접종체가 페트리 접시의 가장자리에서 중앙까지 지그재그 방향으로 이동해서 접종구가 전체 페트리 접시를 덮도록 하세요.
4. 페트리 접시는 CO2 없는 인큐베이터에서 26°C에서 72시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이팅합니다. 부화 기간이 끝나면 작은 흰색 군집이 보입니다. 군집을 즉시 사용하지 않는다면, 뚜껑을 파라필름으로 밀봉하고 접시를 거꾸로 놓아 4°C에서 보관하세요. 군체는 최대 6개월까지 이렇게 보관할 수 있습니다.
5. 24웰 조직 배양판의 각 웰에 액체 배양 배양 배양액 2ml를 옮깁니다. 접종된 페트리 접시에서 두 개의 군락을 접종 바늘로 가져와 조직 배양 플레이트의 첫 번째 웰에 넣습니다. 남은 23개의 우물에 대해 같은 절차를 반복합니다.
6. 조직 배양판을 30°C에서 7일간 인큐베이팅합니다. 이렇게 하면 직경 16mm, 두께 약 2-3mm의 총 24개의 BNC 펠리클이 생성되며, 그림 1에 나타난 바와 같습니다. 메모: 예를 들어, 배양 기간 동안 배양물을 흔들어 박테리아 배양물을 건드리지 마십시오. 배화 기간 동안 G. xylinus 는 글루코피라노스 당 분자를 압출하여 공기-액체 계면에서 고분자 결정 망을 형성하며, 정적 배양 조건에서 플라스크의 형태와 크기를 채택합니다. 이 고합 기질은 박테리아 나노셀룰로오스(BNC)로 알려져 있으며, 배양 기간 말에 눈에 띈다.
7. 성장 배지에서 BNC 펠리클을 채취하여 50°C에서 1시간 동안 100ml NaOH 용액에 살균하여 G. xylinus의 모든 흔적을 제거합니다. 선택적으로, 자석 막대와 교반판을 사용해 300rpm에서 이 용액을 저어줄 수도 있습니다. NaOH 용액은 버리고 갓 준비된 1% NaOH 용액 200ml를 추가하세요. 같은 과정을 한 번 더 반복하거나 용액 내 BNC 펠리클이 반투명한 모습을 얻을 때까지 반복합니다.
8. BNC 펠리클을 물로 세 번 헹구고 RT에서 고순도의 물에 보관하세요. BNC 펠리클이 물에 완전히 잠겨 있고 절대 마르지 않도록 하세요.
9. BNC 펠리클을 121°C에서 20분간 오토클레이브합니다. 참고: Märtson과 동료들이 수행한 쥐 내 피하 연구에서는 착상 후 60주 후 BNC의 분해 징후가 없음을 보였습니다. 실제로 BNC는 포유류에는 존재하지 않는 미생물 및 곰팡이 효소에 의해 자연적으로 분해될 수 있습니다. 반면, BNC의 생분해성은 생체 내에서 미세섬유 네트워크를 약화시키는 기계적, 화학적, 생물학적 과정의 결과일 수 있습니다.

결과

그림 1. 박테리아 나노셀룰로오스의 거시적 측면. BNC 펠리클은 11일간의 잠복 기간을 거쳐 얻어졌으며, 이는 대략 두께는 3mm입니다. 잠복 기간은 의도된 용도의 요구사항에 따라 달라집니다.

재료