환경 샘플에서 식물성 세포의 표적 용해를 통한 내포자 분리

초록

출처: Wunderlin, T. 외. 환경 샘플에서 영양세포의 표적 용해를 통한 내포자의 물리적 분리. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 식물성 세포와 다양한 박테리아가 포함된 환경 샘플에서 내포자를 분리하는 방법을 시연합니다. 이 절차는 여과, 기계적 교란, 선택적 화학적 처리를 포함하며, 영양 세포를 약화시키고 용해하면서 내포자를 보존합니다. 마지막 단계는 막 여과를 통해 강인한 내포자를 분리합니다.

프로토콜

1. 화학물질 및 장비 준비

1. 1% 헥사메타인산나트륨(SHMP)(NaPO₃)_n 용액 500ml를 만들어 오토클레이빙으로 멸균합니다.

2. 니트로셀룰로오스(NC) 필터(공구 크기 0.22 μm, 직경 47mm)를 닫힌 유리 페트리 접시에서 오토클레이빙하여 멸균합니다.

3. NC 필터(기공 크기 0.22 μm, 직경 25 mm)를 닫힌 유리 페트리 접시에서 오토클레이빙하여 멸균합니다.

4. 멸균 50ml 튜브(캡 착용) (샘플당 한 튜브)의 빈 무게를 측정하고 기록합니다.

5. Tris-EDTA-버퍼(TE-버퍼) 1회 준비: 10 mM Tris(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄)와 1 mM EDTA 버퍼를 혼합한 용액을 만듭니다. pH를 8로 조절하고 오토클레이핑으로 멸균하세요.

6. 0.02 g의 라이소자임을 1ml TE-버퍼에 용해하여 라이소자임 용액(20 mg/ml)을 준비합니다. 이상적으로는 매번 신선하게 만드는 게 좋습니다. 4°C에서 1주일을 넘지 않고 보관하세요.

7. 염화나트륨(NaCl) 8g/L을 증류수에 녹여 생리학적 용액을 제조합니다. 오토클레이빙으로 멸균하세요.

2. 생물량과 퇴적물 분리

1. 에탄올 불꽃 금속 스쿱을 사용해 미리 무게 측정된 멸균 50ml 튜브에 3g의 침전물 샘플을 첨가합니다. 오염을 방지하기 위해 깨끗하고 UV 멸균된 생체 안전 캐비닛에서 이 작업을 수행하세요.

2. 멸균 점차 뷰렛을 사용해 1% 멸균(오토클레이브) SHMP 용액 15ml를 샘플에 첨가합니다. SHMP 용액은 오염을 방지하기 위해 필터링도 가능합니다.

3. 액체 분산기/균질제(예: Ultra-Turrax 균질제)로 퇴적물과 SHMP 용액을 균질화합니다. 70% 에탄올은 분산 로터를 멸균 또는 오토클레이브로 사용하세요. 17,500rpm에서 1분간 균질화를 돌리세요. 시료를 2분간 휴지시키고 같은 로터 속도로 1분간 균질화를 반복합니다.

4. 샘플을 10분간 두세요. 이 단계에서 가장 무거운 입자(광물)가 가라앉습니다. 하지만 세포와 샘플의 유기 성분은 용액 내에 남아 있습니다. 그 후, 세포 생체량을 포함한 상상액을 깨끗한 50ml 튜브에 옮기되, 침전물 펠릿을 건드리지 않도록 주의하세요.

5. 침전물 펠릿에 멸균 점차 뷰렛을 사용해 1% 멸균(오토클레이션) SHMP 용액 15ml를 다시 첨가합니다. 그 다음 2.3 , 2.4단계를 반복하세요. 이 반복은 퇴적물의 광물 성분에서 세포와 유기 입자의 최대 분리를 보장합니다. 이 두 번째 분리의 상정액은 첫 번째 분리의 상정액과 합칠 수 있습니다.

메모: 다음 단계들은 모두 세포 생체량을 포함하는 상청액에 대해 수행됩니다. 광물 성분(퇴적물 펠릿)은 버릴 수 있습니다.

6. 샘플을 20 x g에서 1분간 원심분리합니다. 이 단계는 생물학적 세포 물질이 여전히 용액 내에 남아 있는 상태에서 작은 광물 입자를 가라앉힐 만큼 g-포스를 증가시킵니다. 원심분리 후에는 세포 생체량을 포함한 상정액을 깨끗한 50ml 튜브로 옮깁니다. 광물 펠릿은 버리세요.

7. 샘플을 무게 재어 바이오매스를 포함한 용액의 최종 부피를 결정합니다. 무게 측정은 샘플을 눈금이 있는 실린더로 옮길 필요를 줄여 오염 위험을 줄여줍니다.

3. 여과막에 생체량 수집

1. 47mm 직경 멤브레인용 여과 장치와 진공 펌프를 준비합니다. 여과 장치를 오토클레이브로 멸균하거나(파이렉스 유리의 경우 70% 에탄올을 뿌리고 번젠 버너로 불을 붙여 멸균하세요). 프로토콜을 계속하기 전에 식혀야 합니다.

2. 에탄올 불꽃으로 멸균된 겸자를 사용해 여과 장치에 멸균 NC 멤브레인을 추가합니다.

3. 2.6단계의 상청액 샘플의 절반을 막 여과 장치에 추가하고 진공 펌프를 사용해 세포를 채취합니다.

4. 액체가 필터를 완전히 통과하면 진공 펌프를 멈추고 에탄올 불꽃 멸균 겸자로 막을 조심스럽게 제거합니다. 막을 멸균된 페트리 접시에 넣으세요.

1. 에탄올 불꽃 살균 가위로 막을 반으로 자른다. 멤브레인의 각 절반을 각각 2ml 튜브에 추가하세요. 막의 절반은 DNA 추출과 전체 박테리아 군집 분석에 사용됩니다. 필터의 나머지 절반은 -80°C에 저장되어 백업 역할을 합니다.

5. 새로운 NC 멤브레인을 여과 장치에 설치하고, 진공 펌프를 사용해 샘플 부피의 후반부( 2.6단계)에서 바이오매스를 수집합니다.

6. 액체가 필터를 완전히 통과하면 진공 펌프를 멈추고 에탄올 불꽃으로 멸균된 겸자로 막을 조심스럽게 제거합니다. 멤브레인 전체를 별도의 2ml 튜브에 넣으세요. 이 샘플은 영양세포에서 내포자를 분리하는 치료에 사용됩니다. 샘플은 사용 전까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

4. 영양 세포 용해

1. 이전에 NC 막에 수집된 생체량에서 영양세포로부터 내포자를 분리하는 처리를 수행한다(단계 3.6).

1. 막이 얼어 있었다면, 10분간 RT에 두어 해동하세요. 그 후 막을 멸균된 페트리 접시에 넣고 에탄올 불꽃으로 만든 멸균 가위로 약 4번 더 작은 조각으로 자릅니다. 그 다음 모든 멤브레인 필터 조각을 멸균된 2ml 튜브에 넣으세요.

2. 샘플 막이 포함된 튜브에 1x TE(Tris-EDTA) 완충제 900μl(참조 1.5)을 추가하고 와류로 완전히 혼합합니다. 이 단계에서 바이오매스는 막에서 TE-버퍼 용액으로 제거됩니다.

3. 튜브를 65°C에서 인큐베이터에 넣고 10분 80rpm 동안 보관합니다. 그 후 인큐베이터에서 튜브를 분리해 15분간 식히세요.

4. 신선하게 준비한 라이소자임 100 μl(참조 1.5)을 추가하여 최종 농도는 2 mg/ml에 도달합니다. 샘플이 37°C로 식기 전에는 라이소자임을 첨가하지 마세요. 이는 효소를 분해할 수 있기 때문입니다.

5. 샘플을 37°C에서 60분 80rpm 배양하는데, 이는 리소자임이 식물 세포를 용해하기에 최적의 조건입니다.

6. 용해가 완료된 후, 샘플에 3N 수산화나트륨(NaOH) 250 μl과 6% 도데실 황산나트륨(SDS) 250 μl 용액을 첨가합니다. 이를 더하면 시료 부피는 1.5ml에 도달하며, 최종 농도는 0.5 N NaOH이고 최종 농도는 1% SDS가 됩니다.

7. 이 혼합물을 RT에서 60분, 80rpm 동안 인큐베이팅합니다. 베이스와 세제를 추가하면 최종 세포 용해에 도움이 됩니다. 이 세제들의 농도는 식물 세포를 용해하는 동안 내포자를 해치지 않도록 최적화되어 있습니다.

8. 25mm 직경의 막을 고정하는 무균 여과 장치를 준비하는데, 오토클레이빙 또는 파이렉스 유리의 경우 70% 에탄올을 분사하고 번젠 버너로 불을 붙입니다. 식히세요.

9. 에탄올 화염 멸균 겸자를 사용해 여과 장치에 0.2 μm NC 막(직경 25mm)을 부착합니다.

10. 4.7단계의 샘플을 멤브레인에 넣고 진공 펌프로 액체를 여과합니다. 액체가 통과하면 진공 펌프를 끄세요. 이 단계에서 용해된 식물성 세포 물질은 막에 남아 있지 않으므로 제거됩니다. 막에는 내포자만 남게 됩니다.

11. 멸균 생리용 용액 2ml를 추가해 잔여 세제를 씻어내고 진공 펌프로 액체를 걸러냅니다.

12. 액체가 완전히 여과되면, 진공 펌프를 끕니다. 멤브레인은 여과 장치에 그대로 두세요.

재료