대장균에서 형광 태그 억제 단백질 매개 복제 차단

초록

출처: Mettrick, K. A., Lawrence 외, 형광 억제자 조작 시스템을 이용한 대장균 에서 부위 특이적 복제 차단 유도. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 아라비노스가 유도한 노란색 형광 단백질 표지 TetR의 발현을 이용해 대 장 균에서 부위특이적 복제 포크 차단을 시연하며, 이 단백질이 염색체 tetO 배열에 결합합니다.

프로토콜

1. 형광 억제 조작 시스템(FROS)을 이용한 복제 차단

1. 복제 차단 유도
   1. tetO 배열과 pKM118 to OD₆₀₀nm = 0.01 크기의 E. coli 균주를 신선한 밤샘 배양물을 희석 복합 배지(0.1% 트립톤, 0.05% 효모 추출물, 0.1% NaCl, 0.17 M KH₂PO₄, 0.72 M K₂HPO₄)에서 필요에 따라 항생제와 희석합니다.
      메모: 테트라사이클린은 이 시스템과 호환되지 않으므로, 선택을 위해 첨가하지 마십시오. 배양액의 부피를 샘플당 10ml로 맞추세요. 예를 들어, 그림 1 의 실험 설계의 배양 부피는 60ml입니다.
   2. 30 °C에서 흔들면서 OD₆₀₀ nm = 0.05-0.1까지 성장시킵니다. 10ml 샘플을 추출하여 유도되지 않은 대조군으로 사용하고, 남은 배양물에 0.1% 아라비노스를 첨가하여 pKM1에서 TetR-YFP를 유도합니다. 유도되지 않은 배양과 유도된 배양 모두를 계속 키우세요. 1시간 후에는 형광 현미경을 사용해 유도 배양 세포 내 단일 초점점이 있는지 확인한다.
   3. 유도 세포가 차단된 것으로 확인되면(세포의 70% 이상이 단일 초점을 가지고 있음),_{OD 600nm}를 기록하고 7.5ml 샘플을 채취하여 2D 겔로 분석합니다. 유도되지 않은 대조군 배양에서 동등한 샘플을 채취하세요.

결과

그림 1: FROS 복제 블록 및 방출 실험 절차 개요. tetO 배열을 가진 대장균 은 30 °C에서 배양됩니다. 세포가 OD₆₀₀nm에서 0.05 이상에 도달하면, 아라비노스(ara; 0.1%)로 TetR-YFP 생성이 유도됩니다. 유도되지 않은 세포 소집단을 30°C에서 대조군으로 계속 배양합니다. 유도된 세포 샘플은 1-2시간 후 형광 현미경으로 분석합니다. 복제가 차단된 것으로 확인되면 시...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립톤	시그마-올드리치	16922	성장 매체 구성 요소
소금	VWR	27810.364	성장 매체 구성 요소
효모 추출물	시그마-올드리치	92144	성장 매체 구성 요소
인산칼륨 단염성	시그마-올드리치	P9791	성장 매체 구성 요소; 칼륨 완충 성분
인산칼륨 이염기	시그마-올드리치	P3786	성장 매체 구성 요소; 칼륨 완충 성분
L-아라비노스	시그마-올드리치	A3256	TetR-YFP 생성 유도를 위해
Axioskop 2 형광 현미경	자이스	452310	셀의 시각화
eYFP 필터 세트	크로마 기술	41028	YFP의 시각화
CCD 카메라	하마마쓰	오르카-AG	셀의 시각화
MetaMorph 소프트웨어 (분자 장치)	SDR 사이언티픽	31282	이 원고 준비에 사용된 버전 7.8.0.0