박테리아 유전자 검출을 위한 루프 매개 등온 증폭

초록

출처: 돔슬, K. J. 외. 동물성 식품 내 살모넬라 선별과 배양 분리 확인을 위한 루프 매개 등온 증폭. J. Vis. 경험 (2020).

이 영상은 일정한 온도에서 DNA를 증폭하여 목표 박테리아 유전자를 검출하는 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 기법을 시연합니다. 반응 혼합물은 등온 마스터 믹스, 표적 유전자에 대한 특정 프라이머, DNA 주형이 포함된 샘플을 첨가하여 준비됩니다. 증폭은 LAMP 기기에서 시작되며, 실시간 형광 모니터링을 통해 표적 유전자의 존재를 확인합니다.

프로토콜

참고: 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 반응 혼합물에는 DNA 중합효소, 완충제, 황산마그네슘(MgSO₄), 디옥시뉴클레오타이드 삼인산(dNTP), 프라이머, DNA 주형, 그리고 물이 포함되어 있습니다. 처음 네 가지 시약은 등온 마스터 혼합물(재료표)에 포함되어 있습니다. 프라이머는 사내에서 미리 혼합되어 프라이머 혼합액(10배)으로 만듭니다. DNA 템플릿은 선별 목적으로 동물 식품 샘플의 농축 육수에서 추출하거나, 확인을 위해 추정되는 살모넬라 분리 균의 배양에서 추출할 수 있습니다. 또한, 모든 LAMP 검사에는 양성 대조군(살 모 넬라 기준 균주에서 추출한 DNA, 예: Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2])과 무주형 대조군(NTC; 멸균 분자급 수)이 포함됩니다.

1. DNA 템플릿 준비

1. 동물 식품 강화 식품에서 DNA 템플릿을 준비하려면 다음 단계를 따르세요.
   1. 멸균된 필터백(재료표 양식)에 동물성 사료 샘플(예: 건식 고양이 사료, 건식 사료, 소 사료, 말 사료, 가금류 사료, 돼지 사료)을 무균 무게로 무게를 젊합니다. 부화 기간 동안 지지할 수 있도록 큰 용기나 선반에 가방을 넣으세요.
   2. 멸균 완충 펩톤 워터(BPW) 225mL를 추가합니다. 소용돌이치고 짧은 손 마사지로 잘 섞어주세요. 실온에 60분± 5분간 두세요.
   3. 잘 섞어 섞은 후 시험지로 pH를 측정하세요. 필요 시 pH를 6.8 ± 0.2로 조절하고, 멸균 1N 수산화나트륨(NaOH) 또는 1N 염산(HCl)을 사용하세요. 35± 2°C에서 24± 2시간 동안 배화하세요.
   4. 동물성 식품 육수를 담은 봉지를 돌려 잘 섞으세요. 여과된 백 쪽에서 1mL를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 잠깐 보텍스.
   5. 샘플 준비 시약(재료표)을 사용하여 DNA를 추출합니다.
      1. 900 x g 에서 1분간 원심분리기를 통해 큰 입자를 제거하고 상정액을 새로운 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
      2. 16,000 x g 에서 원심분리기를 2분간 사용한 후 상원액을 버립니다.
      3. 펠릿을 샘플 준비 시약 100 μL에 매달고 100 ± 1 °C에서 10분간 건조 열 블록에서 가열합니다.
      4. 실온으로 식힌 후 샘플 DNA 추출물을 -20°C에 보관하세요.
2. 추정되는 살모넬라 배양에서 DNA 템플릿을 준비하려면 다음 단계를 따르세요.
   1. FDA의 BAM 5장 살모넬라 섹션 D: 살모넬라 분리에 따라 모든 식품에서 배양 분리에서 추정 살모넬라 분리균을 얻으십시오.
   2. 추정 살모넬라 분리균을 비선택적 한천 플레이트(예: 혈액 한천, 영양 한천, 트립티카제 대두 한천)에 접종하고, 35 ± 2 °C에서 24시간 ± 2시간 배양합니다.
   3. 여러 개의 단일 콜로니를 5mL의 트립티카제 대두 육수(TSB) 또는 뇌심장 주입(BHI) 육수에 옮겨 35± 2°C에서 16± 2시간 배양합니다.
      참고: 추정되는 살모넬라 배양이 순수한 경우 이 단계는 선택 사항일 수 있습니다. 이 경우 DNA 주형은 5mL TSB에 여러 단일 콜로니를 현탁하고, 현탁액 500 μL를 100 ± 1 °C에서 10분간 건열 블록에서 가열하여 준비할 수 있습니다. 아래 5단계를 계속하세요.
   4. 1박 배양액 500 μL을 마이크로 원심분리관에 옮기고, 100 ± 1°C에서 10분간 건조 열 블록에서 가열합니다.
   5. 상온으로 냉각한 후 분리된 DNA 추출물을 -20°C에 보관합니다.
3. 양성 대조군 DNA를 준비하려면, 추정되는 살모넬라 배양에서 DNA 템플릿을 준비할 때도 위와 유사한 절차를 따를 때 한 단계 추가 희석 단계를 거칩니다.
   1. S . Typhimurium ATCC 19585 (LT2) 또는 살모넬라 참조 균주를 비선택적 한천 플레이트(예: 혈액 한천, 영양 한천, 트립티카제 대두 한천)에 접종하고, 35 ± 2 °C에서 24시간 ± 2시간 배큐합니다.
   2. 여러 개의 단일 콜로니를 5 mL의 TSB 또는 BHI 육수에 옮기고 35 ± 2 °C에서 16 ± 2시간 배큐하여 ~10⁹ CFU/mL에 도달합니다.
   3. 0.1% 펩톤 워터에 하룻밤 배양물을 연속적으로 희석하여 ~10⁷ CFU/mL를 얻습니다.
   4. 이 희석액 500 μL를 마이크로 원심분리관에 옮기고 100 ± 1°C에서 10분간 건열 블록에서 가열합니다.
   5. 실온까지 냉각하고 양성 대조 DNA를 -20°C에 저장하세요.

2. 프라이머 혼합물 준비 (10배)

1. 표준 탈염 정제와 함께 상업적으로 합성된 LAMP 프라이머(Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF, Sal4-LB)를 획득하세요(표 1). 각 프라이머(100 μM)의 스톡 용액을 적절한 양의 멸균 분자급 물로 재수화하여 준비합니다. 10초 동안 소용돌이 현상을 통해 잘 섞고 -20°C(장기 보관은 -80°C)에서 보관하세요.
2. 워크시트(표 2)에 따라 프라이머 혼합액(10배)을 준비하세요. 적절한 양의 프라이머 스톡 용액과 멸균된 분자 등급 물을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣으세요. 모든 시약을 10초 동안 소용돌이로 잘 섞으세요. 10배 프라이머 혼합물을 마이크로 원심분리관당 500 μL로 분할 배치하여 -20 °C에서 보관합니다.

3. LAMP 반응의 조립

참고: 교차 오염을 방지하기 위해 LAMP 마스터 믹스 준비와 DNA 템플릿 첨가에 사용되는 구역을 물리적으로 분리하는 것이 강력히 권장됩니다. 그림 1 은 LAMP 다이어그램입니다.

1. 준비 및 경기 준비
   1. 이소프로판올과 DNA 및 DNase 분해 용액으로 벤치를 깨끗이 정리하세요 (재료표). DNA 및 DNase 분해 용액으로 피펫과 튜브 스트립 홀더(재료표)를 깨끗이 세척하세요.
   2. 등온 마스터 믹스, 프라이머 믹스(10배), 분자등급 물, 양성 대조 DNA, DNA 템플릿을 실온에서 해동합니다.
   3. LAMP 계기판(재료표)을 켜고 오프닝 화면을 탭하면 홈 화면에 접속할 수 있습니다. 다음 단계를 따라 런을 만들어 보세요.
      참고: LAMP 기기의 한 모델은 2개의 블록(A와 B)으로 각 블록에 8개의 샘플이 있고, 또 다른 모델은 8개의 샘플을 수용하는 단일 블록을 가지고 있습니다(재료표).
      1. LAMP+Anneal을 탭하고 Edit를 선택하여 샘플 정보를 입력하세요.
         참고: 기본 LAMP 실행 프로필은 65°C에서 30분간 증폭하고, 98°C에서 80°C까지 어닐 위상을 초당 0.05°C 감소시키는 것으로 구성됩니다.
      2. 각 샘플 행을 탭하면 커서를 활성화하고 AB 블록 아이콘을 사용해 두 LAMP 악기 블록을 전환하여 관련 샘플 정보를 입력할 수 있습니다.
      3. 모든 샘플 정보가 입력되면 체크 아이콘을 탭하세요.
         참고: 선택 사항으로, 실행 설정('프로파일'이라 불리며, 기본 LAMP 실행 프로필과 함께 샘플 정보를 포함함)을 나중에 사용할 수 있도록 저장할 수 있습니다. 저장 아이콘을 탭하고 프로필에 고유한 이름을 부여하세요. 다음에 같은 샘플 세트를 테스트할 때는 저장된 프로필을 사용해 새로운 런을 시작할 수 있습니다. 홈 화면 왼쪽 하단의 폴더 아이콘을 탭하고 프로필 을 선택해 저장된 프로필을 불러오세요.
2. LAMP 반응 조립체
   참고: 두 LAMP 악기 블록(A와 B, 총 16샘플)을 사용할 때는 18샘플용 LAMP 마스터 믹스를 준비하세요. LAMP 악기 블록 하나(총 8샘플)만 사용할 경우, LAMP 마스터 믹스를 10샘플용으로 준비하세요. 다른 샘플 번호의 경우, 피펫팅 손실을 반영해 부피를 조절하세요. 모든 LAMP 검사에는 항상 양성 대조군과 NTC를 포함하세요. 각 샘플을 독립적으로 LAMP 시험으로 중복 검사하는 것이 권장됩니다.
   1. 워크시트(표 3)에 따라 LAMP 마스터 믹스를 준비하세요. 등온 마스터 믹스, 프라이머 믹스, 분자급 물을 적당량 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 3초 동안 부드럽게 소용돌이를 돌립니다.
   2. 튜브 스트립을 스트립 홀더에 넣고 각 웰에 23 μL LAMP 마스터 믹스를 분배합니다.
   3. 모든 DNA 템플릿을 보텍스하고 잠시 원심분리기로 전환하세요. 적절한 웰에 2 μL DNA 주형을 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다.
   4. 튜브 스트립을 홀더에서 빼고 손목을 튕겨 모든 시약이 튜브 바닥에 고였는지 확인하세요.
   5. 튜브 스트립을 LAMP 계기판에 넣고, 뚜껑을 닫기 전에 캡이 고정되었는지 확인하세요.

4. 램프 런

참고: LAMP 실행 중에는 FAM 채널을 통해 형광 측정값을 획득합니다. 시간-피크 값(Tmax; min)은 형광 비율이 증폭율 곡선의 최대 값에 도달하는 시점에 대해 기기에 의해 자동으로 결정됩니다. Tm (°C)은 최종 증폭된 제품의 용융/어닐링 온도입니다.

1. 화면 오른쪽 상단의 'Run' 아이콘을 클릭하고 튜브 스트립이 포함된 블록을 선택하여 LAMP 런을 시작하세요.
2. 선택적으로 반응이 진행 중인 동안 온도, 증폭, 어닐 탭을 눌러 LAMP 실행 중 다양한 매개변수의 동적 변화를 확인할 수 있습니다.
3. 런이 완료되면 증폭 과 어닐 탭을 탭하면 증폭 및 어닐 곡선을 모두 보고, 결과 탭을 누르면 결과를 볼 수 있습니다.
4. 기록 보관을 위해 선택적으로 화면 왼쪽 상단에 있는 런 번호를 "기기 일련번호 number_run 번호"(예: "GEN2-2209_0030")로 기록할 수 있습니다.

표 1: 동물성 사료에서 살모넬라 선별과 배양 분리 확인을 위한 LAMP 프라이머 . 프라이머는 살모넬라 invA 서열(GenBank 등록번호 M90846)을 기반으로 설계되었습니다.

프라이머 명칭	묘사	시퀀스 (5'-3')	길이 (bp)
살4-F3	전방 외부 프라이머	GAACGTGTCGGGGGAAGTC	18
Sal4-B3	뒤쪽 외부 프라이머	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	전방 내부 프라이머	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
살4-BIP	역방향 내부 프라이머	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	루프 포워드 프라이머	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
살4-LB	루프 후방 프라이머	아카카트타	21

표 2: LAMP 프라이머 혼합 준비 워크시트 (10x). 입문서는 표 1에 나열되어 있습니다.

구성 요소	스톡 콘크. (μM)	프라이머 혼합물 콘크. (μM)	부피 (μL)
Sal4-F3 프라이머	100	1	10
Sal4-B3 프라이머	100	1	10
Sal4-FIP 프라이머	100	18	180
Sal4-BIP 프라이머	100	18	180
Sal4-LF 프라이머	100	10	100
Sal4-LB 프라이머	100	10	100
분자급 물	해당 없음	해당 없음	420
합계	해당 없음	해당 없음	1000

표 3: LAMP 반응 혼합물 준비 워크시트. 프라이머 혼합액(10배)은 표 2에 따라 표 1에 나열된 프라이머의 재고 용액을 사용하여 준비됩니다.

구성 요소	작업 중입니다.	최종 반응 의견.	샘플당 부피(μL)	18개 샘플(μL) 부피	10개 샘플(μL) 부피
ISO-001 등온 마스터 믹스	1.67배	1회	15	270	150
프라이머 혼합	10배	1회	2.5	45	25
분자 등급의 물	해당 없음	해당 없음	5.5	99	55
마스터 믹스 소계	해당 없음	해당 없음	23	414	230
DNA 템플릿	해당 없음	해당 없음	2	해당 없음	해당 없음

결과

그림 1: 살모넬라 LAMP 워크플로우의 개략도.

재료