형광 생체분자를 박테리아 세포에 전기천공 기반 전달

초록

출처: Aigrain, L. 외. 전기공공을 통한 생체 미생물 내 형광 생체분자의 내부 추출 및 관찰. J. Vis. 경험 (2015)

이 영상은 전기공공을 이용해 형광 생체분자를 전기적(electroporation)을 이용한 전기적(electro-potation) 미생물 세포에 전달하는 과정을 시연합니다. 이 과정은 형광포자 태그가 부착된 DNA 또는 단백질을 냉각된 세포 현탁액에 주입하는 것으로 시작됩니다. 그 후 고전압 펄스를 가해 임시 막 구멍을 만들어 생체분자가 세포질 내 침투를 가능하게 합니다. 회복 후에는 세포를 세척하고 여과하여 내부화되지 않았거나 표면에 결합된 분자를 제거합니다. 마지막으로, 표지된 세포를 형광 영상을 위해 부착하여 세포 내 구성 요소를 시각화합니다.

프로토콜

1. 전기천공

1. 잠복
   1. 저염 완충제(< 50 mM 염)에 저장된 표지 분자 최대 5 μl을 단일 알리코트 유능 세포(20 μl 박테리아 또는 50 μl 효모)에 첨가하여 얼음 위에서 10분간 배양합니다.
      메모: 스톡 용액 내 형광 표지 분자의 농도와 전기천공 전에 세포에 첨가된 표지 분자의 양은 부하 효율과 직접적인 상관관계가 있습니다(그림 1 및 논의). 일부 단백질은 저염 조건에 적합하지 않기 때문에 저장 완충 내 염 농도를 높일 수 있지만, 전기천공 전에 세포에 추가된 표지 분자의 부피는 줄여야 합니다.
   2. 세포와 표지된 생체분자 혼합물을 미리 냉각된 전기천공 큐벳(박테리아와 효모의 경우 각각 0.1cm와 0.2cm 간격)으로 옮깁니다. 큐벳을 작업대 위에서 살짝 두드려 용액에서 잠재적인 기포를 제거하세요.
   3. 큐벳을 전기공자에 넣고 용액에 고전압 전기 펄스(0.9에서 1.8 kV/cm, 전압 선택에 관한 자세한 내용은 토론 참조)를 가합니다. 이러한 펄스는 세포막에 일시적인 기공을 형성하여 표지된 생체분자가 세포 안으로 확산될 수 있게 합니다.
   4. 전기공공기에 표시되는 시간 상수가 4에서 6ms 사이인지 확인하세요. 시간 상수가 낮으면 염분 농도가 너무 높거나 큐벳 내 기포가 존재하기 때문인 경우가 많아, 셀의 부하가 매우 낮거나 전혀 없게 됩니다.
2. 복구
   1. 전기천공 직후, 세포에 과산화물 억제가 포함된 슈퍼 옵티컬트 육수(SOC), EZ 리치 정의 배지, 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 등 풍부한 배지 500 μl을 세포에 첨가합니다.
   2. 샘플을 박테리아용 37°C, 효모용 29°C에서 2분에서 10분간 배양합니다. 생존 가능성 측정을 위해 전기천공 후 세포의 성장 및 분열 비율을 평가하고자 하는 경우, 첫 세포 분열 전 지연 시간을 관찰하므로 최대 1시간까지 더 긴 회복 시간을 사용합니다.
3. 세척 단계
   1. 세포를 3300 x g, 4 °C에서 1분간 회전시켜 비내화된 생체분자를 제거합니다. 상원액을 버리고 세포를 500μl 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.
      메모: 각 샘플에 대해 동일한 양의 표지된 생체분자로 배양하되, 전자 공공 및 세척 방식과 정확히 같은 방식으로 세척하지 않은 세포의 음성 대조군을 준비합니다.
   2. 이전 단계를 3번 반복하세요.
   3. 단백질 내화의 경우, 관심 있는 표지된 단백질의 특성과 거동에 따라 세척 절차를 최적화합니다. 다음 단계는 가능한 최적화 예시입니다:
      1. 첫 세 번의 세척 사이클은 100 mM NaCl과 0.005% Triton X-100을 포함한 PBS를 사용하여 외부 세포막에 달라붙을 수 있는 비내화된 단백질을 제거합니다.
         1. 전기포링된 셀을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 안에 장착한 0.22 μm 기공 직경 필터를 사용해 전기포링된 셀을 필터에 피펫으로 넣어 필터링합니다. 800 x g, 4 °C에서 3분간 돌리세요. 흐름 부분은 버리세요. 세포 위에 500μl의 새로운 PBS를 추가한 후 이전처럼 다시 돌린 후 이 과정을 한 번 반복합니다.
      2. 첫 세척 사이클에 소량의 프로테아제 K(500 μl PBS에 10 ng)를 첨가하여 내부화되지 않은 단백질의 소화를 돕습니다.
   4. 세포를 3300 x g, 4 °C에서 1분간 돌립니다. 상정액을 버리고 150μl PBS에 다시 부탁합니다.
   5. 상부 커버슬립을 제거하고 세포 현탁액 10μl을 한 방울 단위로 퍼뜨려 아가로스 패드에 적재된 셀 용액을 바릅니다. 사용하지 않은 깨끗하고 탄 커버슬립(두께 1.5, 현미경 대물렌즈 사양에 맞음)을 패드 상단에 교체하고 슬라이드를 아주 부드럽게 누르세요.
   6. 전기공화된 셀을 불투명한 상자에 보관하여 다양한 샘플을 촬영할 때 빛으로부터 보호합니다.

결과

그림 1: 광표백 분석을 이용한 내부화 분자 수 세기. (A) 단일 세포 광표백 분석. 형광 강도 타임트레이스 예시(파란색: 원시 데이터; 빨간색: 적합; 표백 전후 ATTO647N표지된 dsDNA가 적재된 대장균 의 백색 및 형광 이미지). 상단: 단일 단계 표백 사건. 가운데: ±3개의 분자가 포함된 세포가 표백과 깜빡임을 보입니다. 아래: 최소 10개의 분자에 해당하는 >10단...

재료