형광 생체분자를 박테리아 세포에 전기천공 기반 전달

초록

출처: Aigrain, L. 외. 전기공공을 통한 생체 미생물 내 형광 생체분자의 내부 추출 및 관찰. J. Vis. 경험 (2015)

이 영상은 전기공공을 이용해 형광 생체분자를 전기적(electroporation)을 이용한 전기적(electro-potation) 미생물 세포에 전달하는 과정을 시연합니다. 이 과정은 형광포자 태그가 부착된 DNA 또는 단백질을 냉각된 세포 현탁액에 주입하는 것으로 시작됩니다. 그 후 고전압 펄스를 가해 임시 막 구멍을 만들어 생체분자가 세포질 내 침투를 가능하게 합니다. 회복 후에는 세포를 세척하고 여과하여 내부화되지 않았거나 표면에 결합된 분자를 제거합니다. 마지막으로, 표지된 세포를 형광 영상을 위해 부착하여 세포 내 구성 요소를 시각화합니다.

프로토콜

1. 전기천공

1. 잠복
   1. 저염 완충제(< 50 mM 염)에 저장된 표지 분자 최대 5 μl을 단일 알리코트 유능 세포(20 μl 박테리아 또는 50 μl 효모)에 첨가하여 얼음 위에서 10분간 배양합니다.
      메모: 스톡 용액 내 형광 표지 분자의 농도와 전기천공 전에 세포에 첨가된 표지 분자의 양은 부하 효율과 직접적인 상관관계가 있습니다(그림 1 및 논의). 일부 단백질은 저염 조건에 적합하지 않기 때문에 저장 완충 내 염 농도를 높일 수 있지만, 전기천공 전에 세포에 추가된 표지 분자의 부피는 줄여야 합니다.
   2. 세포와 표지된 생체분자 혼합물을 미리 냉각된 전기천공 큐벳(박테리아와 효모의 경우 각각 0.1cm와 0.2cm 간격)으로 옮깁니다. 큐벳을 작업대 위에서 살짝 두드려 용액에서 잠재적인 기포를 제거하세요.
   3. 큐벳을 전기공자에 넣고 용액에 고전압 전기 펄스(0.9에서 1.8 kV/cm, 전압 선택에 관한 자세한 내용은 토론 참조)를 가합니다. 이러한 펄스는 세포막에 일시적인 기공을 형성하여 표지된 생체분자가 세포 안으로 확산될 수 있게 합니다.
   4. 전기공공기에 표시되는 시간 상수가 4에서 6ms 사이인지 ....

결과

그림 1: 광표백 분석을 이용한 내부화 분자 수 세기. (A) 단일 세포 광표백 분석. 형광 강도 타임트레이스 예시(파란색: 원시 데이터; 빨간색: 적합; 표백 전후 ATTO647N표지된 dsDNA가 적재된 대장균 의 백색 및 형광 이미지). 상단: 단일 단계 표백 사건. 가운데: ±3개의 분자가 포함된 세포가 표백과 깜빡임을 보입니다. 아래: 최소 10개의 분자에 해당하는 >10단.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ElectroMax DH5-알파 컴프텐트 셀	인비트로젠	11319-019	또는 상업용 또는 실험실 마법사 전기에 능한 박테리아나 효모 같은 것들.
EZ 리치가 마디아를 정의했다	테크노바	M2105	저형광 풍부 매체
마이크로펄서 전기천공 장치	바이오라드	165-2100	또는 미생물 형질전환을 위한 고전적인 전기공공기
인증 분자생물학 아가로스	바이오라드	161-3100	아가로스 패드용 저형광 아가로스
현미경 커버슬립 No 1.5 두께	멘젤	BB024060SC	배경 입자를 500 °C에서 용광로에서 1시간 가열하여 제거하세요
단일 분자 형광 현미경	자작		REF에 설명되어 있습니다
현지화 소프트웨어	맞춤 작성, 온라인에서 이용 가능		MATLAB 및 C++ 소프트웨어 패키지로, 로컬라이제이션 분석에 적응 가능하다.
추적 소프트웨어	온라인에서 이용 가능		MATLAB 구현은 Blair와 Dufresne에 의해 이루어졌습니다.