Myxococcus xanthus 샘플의 생세포 영상 제제

초록

출처: Schumacher, D. 외 성장 느린 사회성 박테리아 Myxococcus xanthus 의 완전한 영양 세포 주기의 형광 생세포 영상 연구. J. Vis. Exp. (2018)

이 영상은 느리게 자라는 토양 박테리아 인 Myxococcus xanthus 의 제조 및 영상 촬영 과정을 보여줍니다. 배양액은 배양지에서 배양되고, 형광 미세구체가 부착된 커버슬립에 적용되고, 미리 데워진 아가로스 패드를 덮어 수분과 영양 공급을 지원합니다. 이 구조는 박테리아 세포 분열 중 세포 과정을 장기간 타임랩스 라이브 이미징으로 수행할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 현미경 샘플 준비

메모: 현미경으로 관찰할 세포는 현미경 커버슬립에 올려놓고, 영양분이 포함된 아가로스 패드로 덮습니다. 커버슬립은 기계적 지지를 위해 플라스틱 또는 금속 프레임에 접착됩니다. 현미경 검사 준비를 위해 2.1-2.3단계에 설명된 대로 1% 아가로스/TPM/0.2% CTT 비율의 대형 패드를 미리 준비해야 합니다. 여기서 사용되는 특정 제품에 대해서는 재료 표 도 참고해 주세요.

1. 500 mL의 TPM 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM KH₂PO₄ pH 7.6, 8 mM MgSO₄)를 준비하고, 병뚜껑 필터를 사용해 오토클레이브 또는 필터로 멸균합니다.

메모: 멸균 완충제는 실온에서 몇 달간 보관할 수 있습니다.

2. 0.2% CTT가 포함된 1% 아가로스 현미경 용액을 준비합니다(아가로스 1g과 80mL TPM 버퍼 및 1% CTT 배지 20mL를 혼합). 전자레인지에 아가로스가 녹을 때까지 가열하세요.

메모: 0.2% CTT는 세포가 성장하고 기아를 막기에 충분합니다. 현미경 배지 내 CTT 농도가 높을수록 배경 형광이 높아집니다.

3. 녹은 아가로스를 0.5cm 두께로 페트리 접시에 채우고(11.5cm x 11.5cm 정사각형 페트리 접시의 경우 약 60mL의 용융 아가로스가 필요합니다) 실온까지 식힙니다.

메모: 아가로스 패드는 습한 환경에서 4°C에서 최대 2일간 보관할 수 있습니다.

1. 사용 전 최소 15분 동안 1% 아가로스/TPM/0.2% CTT 패드를 32°C에서 예열합니다.

메모: 세포를 현미경 검사에 준비하려면 2.4-2.8단계를 따라야 합니다.

4. 멸균 유리 커버슬립(60 mm x 22 mm, 두께: 0.7 mm)을 중앙에 구멍이 뚫린 플라스틱 또는 금속 프레임에 놓습니다(그림 1A); 이 프레임은 얇은 커버슬립의 기계적 지지 역할을 하며 현미경 촬영 중 드리프트를 줄이는 데 도움을 줍니다. 커버슬립을 테이프로 프레임에 고정하세요.

1. 프레임을 준비하기 위해, 두께 1mm의 금속판에서 75mm × 25mm 프레임을 잘라낸 후, 중앙에 적절한 크기의 구멍(이 실험에서는 20mm × 30mm)을 파냅니다.

5. 커버슬립에 10 - 20 μL 기하급수적으로 성장한 M. xanthus 세포를 추가한다.

6. 형광 0.5 μm 마이크로스피어를 세포에 기준 마커로 추가하여 타임랩스 기록에서 세포나 단백질의 추적을 단순화합니다.

1. 미세구를 TPM 버퍼에 1:100 희석하여 최대 4 °C에서 몇 달간 보관합니다. 사용 전에 충분히 흔들고 희석된 미세구를 5 - 10 μL씩 세포에 첨가하세요.

메모: 여기서는 모든 일반적인 파란색, 녹색, 노란색, 빨간색 형광 채널에서 형광을 띠는 미세구체가 사용되었습니다.

7. 미리 예열된 1% 아가로스/TPM/0.2% CTT 패드의 커버슬립 크기 정도의 작은 패드를 잘라내어 셀 위에 올려놓습니다(그림 1B). 증발을 방지하고 세포를 습한 환경에 유지하기 위해 1% 아가로스/TPM/0.2% CTT 아가로스 패드 위에 커버슬립을 덮어주세요.

메모: 커버슬립만으로도 최소 2시간 동안 상당한 증발을 막을 수 있습니다. 더 긴 타임랩스 녹화의 경우, 1% 아가로스/TPM/0.2% CTT 패드와 커버슬립 샌드위치는 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 밀봉해야 합니다.

8. 현미경 샘플을 32°C에서 15-20분간 배양하여 세포가 아가로스 패드 바닥에 부착되도록 합니다. 그다음 타임랩스 현미경 녹화를 시작하세요.

결과

그림 1: 본 연구 전반에 걸쳐 사용된 실험 장치의 도식도. (A) 금속 또는 플라스틱 프레임이 샘플의 지지대 역할을 합니다. 샘플의 움직임을 줄이기 위해 테이프로 금속 프레임에 커버슬립을 고정합니다. (B) 실험 샘플 세트의 측면 모습. 셀은 (A)에 표시된 커버슬립에 부착됩니다. 세포에 영양분과 습도를 공급하는 아가로스 패드가 세포 위...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AFC와의 DMI6000B	라이카 마이크로시스템	11888945	적응형 초점 제어가 있는 자동 역광시야 형광 현미경
범용 장착 프레임	라이카 마이크로시스템	11532338	다양한 샘플 크기에 대한 스테이지 홀더(stage holder)
HCX PL 플루오타 100x/1.30 오일 PH3	라이카 마이크로시스템	11506197	위상 대물
오르카 플래시 4.0 카메라	하마마쓰	11532952	4.0 메가픽셀 sCMOS 카메라 사진 촬영
필터 세트 TXR ET, k	라이카 마이크로시스템	11504170	형광 필터 세트, 예: 560/40 전자기: 645/75
필터 세트 L5 ET, k	라이카 마이크로시스템	11504166	형광 필터 세트, 예: 480/40 전자기: 527/30
필터 세트 YFP ET, k	라이카 마이크로시스템	11504165	형광 필터 세트, 예: 500/20 전자기: 535/30
프로스캔 III	이전의	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	인터랙티브 제어 센터가 있는 현미경 자동화 컨트롤러
EL 6000 광원	라이카 마이크로시스템	11504115	외부 형광광원
인큐베이터 BLX 블랙	페콘	11532830	현미경을 둘러싼 검은색 인큐베이션 챔버
템컨트롤 37-2 디지털	라이카 마이크로시스템	11521719	인큐베이션 챔버용 자동 온도 제어
겐트마이신 황산염	칼 로스	233.4	겐타마이신
옥시테트라실린 이수화물	시그마 올드리치	201-212-8	옥시테트라사이클린
카나마이신 황산염	칼 로스	T832.3	카나마이신
Filtropur BT25 0.2 병뚜껑 필터	사르스테트	831,822,101	완충제 멸균용 병뚜껑 필터
데크글레이저	VWR	630-1592	유리 커버 슬립 (60 x 22 mm, 두께: 0.7 mm)
Seakem LE 아가로스	론자	50004	현미경 슬라이드용 한쪽 농산물
라이카 메타모프 AF	라이카 마이크로시스템	11640901	현미경 제어 소프트웨어 및 사진 분석을 위한 소프트웨어
사막 미세스퍼, 0.5 μm	서모피셔	T7281	형광 미소구
페트리 접시	그레이너 바이오-원	688102	아가로스 패드용 120mm x 120mm x 17mm 정사각형 페트리 접시
BD 박토 카시토네	벡턴 디킨슨	225930	카시토네
파라필름 M	VWR	291-1213	파라필름
트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄	칼 로스	AE15.2	트리스
황산마그네슘 헵타하이드레이트	칼 로스	P027.2	황산마그네슘
인산칼륨 이수소 p.a.	칼 로스	3904.1	인산칼륨 이수소
1% CTT 배지: 1% (w/v) BD 박토™ 카시톤, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 1 mM 인산칼륨 완충 pH 7.6, 8 mM MgSO₄			M. xanthus 재배 배지
TPM 완충액: 10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 1 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.6, 8 mM MgSO₄			M.xanthus 현미경 슬라이드 준비를 위한 완충제