모델 단백질의 열 전개를 통한 박테리아 샤페론 활성 평가

초록

출처: Dahl, J. 외 시험관 및 생체 내에서 대장균 샤페론 HdeB의 pH 의존성 활성 검출. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 산성 및 열 스트레스 하에서 기질 단백질에 대한 샤페론 활성을 평가하기 위한 형광 분광광도계 기반 분석법을 시연합니다. 이 문서는 빛 산란을 통한 기질 전개 및 집적 모니터링 단계, 인솔이 있는 상태와 없는 상태 비교를 설명합니다.

프로토콜

1. 열적으로 펼쳐지는 말산 탈수소효소(MDH)를 이용한 샤페론 활성 분석법

메모: 정제된 HdeB가 서로 다른 pH 값에서 열적으로 펼쳐지는 돼지 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소(MDH)의 응집에 미치는 영향은 아래에 설명된 대로 모니터링되었습니다. 나열된 모든 단백질 농도는 단량체 농도를 의미합니다.

1. MDH를 제조하기 위해 MDH를 4 °C에서 4L 완충 C(50 mM 인산칼륨, 50 mM 염화나트륨(NaCl), pH 7.5)에 대해 하룻밤 동안 다해리로 전환하고, 분자량 차단 30 kDa의 원심 여과 유닛을 사용해 단백질을 약 100 μM까지 농축합니다.
   메모: MDH는 암모늄 황산염 용액으로 전달되므로 신중한 투석이 필요합니다.
2. 응집체를 제거하기 위해, 단백질을 20분간 20분간 원심분리하여 4°C에서 측정합니다. MDH 농도를 280nm(ε_280nm= 7,950 ^{M-1 cm-1})에서 흡광으로 측정합니다. 50μl 알리코트 MDH를 준비하고 급속 냉동하여 보관하세요.
3. 1ml 석영 큐벳을 온도 제어 샘플 홀더와 교반기가 장착된 형광 분광광도계에 넣습니다. λ_ex/em 을 350 nm로 설정하세요.
4. 미리 예열된 43 °C의 버퍼 D(150 mM 인산칼륨, 150 mM NaCl)를 원하는 pH 값(여기: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, pH 5.0)에 적정 양의 큐벳에 추가하고, 큐벳 홀더의 온도를 43 °C로 설정합니다. 총 부피는 1,000 μl입니다.
5. 버퍼에 12.5 μM HdeB(또는 버퍼 제어용 동일한 용량의 HdeB 저장 버퍼)를 추가한 후 0.5 μM MDH를 추가합니다. 빛 산란 모니터링을 시작하세요. 반응을 360초간 배양하여 MDH가 충분히 전개되도록 하세요.
6. 2 M 무완충 K₂HPO₄ 를 0.16-0.34 부피로 추가하여 pH를 7로 올리고, 빛 산란을 440초 더 기록하세요.
7. 중화 후 정해진 시점(이하 500초, MDH의 최대 광산란이 관찰된 시점)에 샤페론이 없을 때 기록되는 MDH 집적 범위를 100%로 설정하세요. HdeB가 없는 상태에서 각 pH 값에서 HdeB의 활성을 MDH의 빛 산란 신호에 정규화합니다.

재료