산 스트레스 하에서 대 장균 에서 산 활성화 샤페론의 보호 역할 평가

초록

출처: Dahl, J. 외 시험관 및 생체 내에서 대장균 샤페론 HdeB의 pH 의존성 활성 검출. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 재조합 대장균 배양을 이용해 산 활성화 샤페론이 산 스트레스 시 보호 효과를 평가하는 과정을 보여줍니다. 박테리아 성장 모니터링은 샤페론 발현 배양에서 대조군에 비해 생존율이 향상되었음을 보여주며, 스트레스 조건에서 단백질 안정화에서 샤페론의 역할을 강조합니다.

프로토콜

1. 샤페론 HdeB 과발현이 산성 스트레스 하에서 대장균 생존에 미치는 영향

참고: 대장균 MG1655 유전체 DNA는 표준 프로토콜을 사용하여 분리되었습니다.

1. PCR로 대장균 MG1655의 샤페론 hdeB를 증폭합니다. pprimers, hdeB-BamH, I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT, CGG, CAA GTC ATT, HDEB-EcoR,I-FW GGT GCC GAA TTC AGG CGC ATG AAT ATT TCT CTC C. C.
2. PCR 반응을 50 μl에서 다음과 같이 설정하세요: 10 μl 5x 폴리머라제 버퍼, 200 μM dNTP, 0.5 μM 프라이머 JUD2, 0.5 μM 프라이머 JUD5, 150 ng 게놈 DNA MG1655, 0.5 μl DNA 중합효소, ddH₂O를 50 μl에 첨가.
3. hdeB 증폭은 다음과 같이 수행한다: 1단계: 95 °C에서 5분, 1 사이클; 2단계: 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 30초, 40사이클; 3단계: 72°C에서 10분.
4. 표준 제한 부위 클로닝 방법을 사용하여 플라스미드 pBAD18의 EcoRI 및 BamHI 부위로 PCR 분열을 클론합니다. 제조사 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용해 플라스미드를 정제하세요. 시퀀싱으로 결과 플라스미드를 검증하세요.
5. HdeB를 발현하는 플라스미드 또는 빈 벡터 제어 pBAD18을 균주 BB7224 (ΔrpoH) (유전자형: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn 10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) 화학적 유능 세포를 이용한 연구입니다.
   메모: 이 균주는 온도에 민감합니다.
6. 42 °C에서 45초간 열충격을 받은 후 도금 전, 30 °C와 200 rpm에서 세포를 배양합니다. 양성 클론의 단일 군락 스트릭 아웃을 수행하고 30°C에서 하룻밤 배양합니다. 50ml LB_앰프 에서 하룻밤 배양을 준비하고 세포를 200rpm, 30°C에서 배양합니다.
7. 25 ml_{LB 앰}프에 40배 배 배양액을 희석하여 0.5% 아라비노스(Ara)를 30 °C, 200 rpm에서 O.D.600nm = 1.0 배양하여 HdeB 단백질 발현을 유도합니다.
8. pH 이동 실험에서는 LB_Amp+Ara 를 사용해 세포를 _O.D.600nm 0.5로 희석하고, 적절한 부피인 5 M HCl을 추가하여 해당 pH 값(여기서는 pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0)에 맞게 조정합니다.
9. 지정된 시점(pH 2, 1분; pH 3, 2.5분; pH 4, 30분) 이후에는 적절한 부피인 5M NaOH를 첨가하여 배양물을 중화시킵니다.
10. 중화된 배양의 증육을 30°C에서 12시간 동안 O.D. 측정을 사용해 모니터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NEB10-베타 대장균 세포	뉴잉글랜드 바이오랩스	C3019I
암피실린	골드 바이오테크놀로지	A-301-3
LB 브로스 믹스, 레녹스	LAB 익스프레스	3003
F-4500 형광 분광광도계	히타치	FL25
위저드 플러스 미니프렙 키트	프로메가	A1470	플라스미드 정제에 사용
L-아라비노스	골드 바이오테크놀로지	A-300-500
형광 세포 큐벳	헬마 애널리틱스	119004F-10-40
올리고뉴클레오타이드	인비트로젠
퓨전 고충실도 DNA 중합효소	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0530S
dNTP 집합	인비트로젠	10297018
염산	피셔 사이언티브	A144-212
수산화나트륨	피셔 사이언티브	BP359-500
베리티 96-웰 열 사이클러	써모피셔	4375786