이 영상은 어류 병원성 박테리아에서 유래한 형광 표지된 가변수 탠덤 반복(VNTR) 증폭체를 모세관 전기영동을 이용해 크기별 전기영동 프로파일을 생성하여 박테리아 식별을 위한 과정을 시연합니다.
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방법 논문
가변 수 탠덤 반복(VNTR) 분석을 이용한 어류 병원체 검출
432 조회수
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2025년 11월 28일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 모세관 전기영동 설정 및 실행 조건
- PCR(중합효소 연쇄반응) 증폭자가 확인된 후, 정제된 물에 1:10(v/v)으로 희석한 PCR 산물을 사용합니다. 밀봉, 혼합, 그리고 원심분리기를 잠시 하세요.
- 연기 캐비닛에서 작업하며, PCR 제품당 9 μL 포름아마이드와 0.5 μL 표준 크기 용량으로 구성된 마스터 믹스 부피를 준비합니다(10% 초과 부피 허용). 잠시 소용돌이로 9.5 μL을 CE(모세관 전기영동) 시스템에 적합한 플레이트 위의 웰에 분포한 후, 희석된 PCR 산물 0.5 μL을 추가합니다. 밀봉, 혼합, 그리고 원심분리기를 잠시 하세요.
주의: 조심해서 다루세요. 포르아마이드를 물과 섞으면 개산이 생성되는데, 이는 독성이 있습니다. - PCR 열 사이클러를 사용해 샘플을 95 °C에서 3분간 변성시키고, 이후 4 °C로 무한히 냉각합니다. 원심분리기를 잠시 하고 제조사 지침에 따라 보정된 CE 시스템에 플레이트를 적재하세요.
- 선택한 장비와 다음 설정에 따라 시약을 사용하여 CE 파편 분석을 수행하세요: 60 °C; 1.6 kV(32 V/cm) 5초 주입; 15 kV(300 V/cm)에서 32분 가동 시간. 24 모세관(50 cm) 24개의 우물에 대한 CE 파편 분석은 일반적으로 약 50분 정도 소요됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Avant 3500xL 유전자 분석기 | 써모피셔 사이언티브 | A30469 | 모세관 전기영동 단편 분석에 사용됩니다. |
| BioNumerics7 모듈 | 응용수학 | NA | MLVA 데이터로부터 최소 스패닝 트리를 생성하는 데 사용됩니다. |
| 원심분리기 | 선호하는 대로. | NA | |
| 에펜도르프 세이프락 튜브, 1.5 mL | 에펜도르프 | 30120086 | DNA 추출 중에 사용된 원심분리기 튜브. |
| 냉장고 | 선호하는 대로. | NA | |
| 연기 보관소 | 선호하는 대로. | NA | |
| GeneMapper 소프트웨어 5 | 써모피셔 사이언티브 | 4475073 | 모세관 전기영동에서 전기영동을 읽는 데 사용됩니다. |
| GeneScan 600 LIZ 염료 크기 표준 v2.0 | 써모피셔 사이언티브 | 4408399 | 모세관 전기영동 중에 사용되는 크기 표준. |
| 하이-디 포르마마이드 | 써모피셔 사이언티브 | 4311320/4440753 | 모세관 전기영동 중에 탈이온화된 포름아마이드가 사용됩니다. 작업 알리쿠아웃을 준비하세요. |
| 밀리-Q 물 | NA | NA | PCR 및 모세관 전기영동 중에 사용되는 정제수. 표준 레시피; 자체 제작. |
| 멀티플렉스 PCR 플러스 키트 | 치아겐 | 206151/206152 | |
| PCR 열 사이클러 | 선호하는 대로. | NA | |
| 3500 DX/3500xL Dx 유전자 분석기용 POP-7 폴리머 | 써모피셔 사이언티브 | A26077/4393713/4393709 | 모세관 전기영동 중에 사용되는 분리 매트릭스. |
| 순수 배양 예르시니아 루케리 | NA | NA | 예를 들어, 냉동 보존 또는 신선한 상태. |
| RNase 없는 물 | 치아겐 | NA | 내장: 멀티플렉스 PCR 플러스 키트 |
| 트리스-보레이트-EDTA (TBE) 버퍼 | NA | NA | 표준 레시피; 자체 제작. |
| 트립신 대두 한천/소 혈액 한천 | NA | NA | 표준 레시피; 자체 제작. |
| 보텍서 | 선호하는 대로. | NA |
