가변 수 탠덤 반복(VNTR) 분석을 이용한 어류 병원체 검출

Abstract

출처: 굴라, S. 외. 다중성 PCR 및 모세관 전기영동을 이용한 어류 병원성 박테리아 Yersinia ruckeri 의 다중 좌위 변수 연합 반복 분석. J. Vis. 경험 (2019).

이 영상은 어류 병원성 박테리아에서 유래한 형광 표지된 가변수 탠덤 반복(VNTR) 증폭체를 모세관 전기영동을 이용해 크기별 전기영동 프로파일을 생성하여 박테리아 식별을 위한 과정을 시연합니다.

Protocol

1. 모세관 전기영동 설정 및 실행 조건

1. PCR(중합효소 연쇄반응) 증폭자가 확인된 후, 정제된 물에 1:10(v/v)으로 희석한 PCR 산물을 사용합니다. 밀봉, 혼합, 그리고 원심분리기를 잠시 하세요.
2. 연기 캐비닛에서 작업하며, PCR 제품당 9 μL 포름아마이드와 0.5 μL 표준 크기 용량으로 구성된 마스터 믹스 부피를 준비합니다(10% 초과 부피 허용). 잠시 소용돌이로 9.5 μL을 CE(모세관 전기영동) 시스템에 적합한 플레이트 위의 웰에 분포한 후, 희석된 PCR 산물 0.5 μL을 추가합니다. 밀봉, 혼합, 그리고 원심분리기를 잠시 하세요.
   주의: 조심해서 다루세요. 포르아마이드를 물과 섞으면 개산이 생성되는데, 이는 독성이 있습니다.
3. PCR 열 사이클러를 사용해 샘플을 95 °C에서 3분간 변성시키고, 이후 4 °C로 무한히 냉각합니다. 원심분리기를 잠시 하고 제조사 지침에 따라 보정된 CE 시스템에 플레이트를 적재하세요.
4. 선택한 장비와 다음 설정에 따라 시약을 사용하여 CE 파편 분석을 수행하세요: 60 °C; 1.6 kV(32 V/cm) 5초 주입; 15 kV(300 V/cm)에서 32분 가동 시간. 24 모세관(50 cm) 24개의 우물에 대한 CE 파편 분석은 일반적으로 약 50분 정도 소요됩니다.

Materials