세우도모나스 시링기에서 박테리오신 매개 살해를 감지하기 위한 연성 한천 오버레이 분석

초록

출처: Hockett, K. L., Baltrus, D. A. 소프트-한천 오버레이 기법을 이용한 박테리아 생성 억제성 화합물 선별. J. Vis. 경험 (2017)

이 영상은 항생제 유도 공여자 균주에서 상원액을 검사 균주가 포함된 부드러운 한천 오버레이에 점검하여 박테리오신 매개 살해를 감지하는 절차를 시연합니다. 배양 후 형성된 투명 구역은 박테리아 억제를 나타냅니다.

프로토콜

1. 오버레이 준비 및 상청액 활성 검사

1. 감도 검사를 위해 P. 시링에 균주 단일 군락을 3ml KB(킹스 미디엄 B)에 접종하고, 상온에서 진동시키며 하룻밤 배양합니다.
2. 다음 날 아침, 배양액을 1/100 다시 희석하여 신선한 KB로 만듭니다. 상온에서 흔들며 3-4시간 정도 배양하세요.
3. 멸균된 물 한천을 0.35-0.7% (w/v) 한천을 초순수수에 오토클레이빙하여 준비합니다.
   메모: 연수 한천은 전자레인지에서 녹여서 반복해서 재사용할 수 있습니다; 각 실험마다 새로운 오버레이를 준비할 필요는 없습니다. 물 한천을 재사용할 경우, 전자레인지 후 완전히 녹이는 것이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 오버레이가 굳어질 때 거친 질감이 되어 해석이 어려워집니다.
4. 사용 전에 녹은 부드러운 한천을 60°C 수조에 보관하세요. 멸균 혈청학적 피펫을 사용해 3ml의 연성 한천을 멸균 배양관에 옮깁니다. 배양관을 다시 물욕으로 돌려 용융 상태를 유지하세요.
5. 오버레이를 부을 때는 먼저 녹은 한천을 식히세요(만졌을 때 따뜻하지만 뜨겁지 않게 느껴져야 합니다). 하지만 굳어지지 않도록 하세요.
6. 멸균 후드에서 100μl의 시험 균주 배양물을 연성 한천과 소용돌이에 접종하여 혼합합니다. 배양물을 손으로 10-15초 돌린 후, 바닥 한천(KB 한천)에 부어줍니다. 접시를 사방으로 기울여 부드러운 한천이 바닥 한천을 고르게 덮도록 하세요.
   메모: 바닥 한천은 시험 균주가 활발히 성장하는 고체화된 1.5% 한천 배지일 수 있습니다. 표준 100mm 직경의 페트리 접시에는 용융 매체를 ~20ml로 사용하세요. 바닥 한천은 건조 없이 4°C에서 유지할 경우 몇 주 전에 준비할 수도 있고, 같은 날 준비할 수도 있습니다.
7. 접시를 덮고 20-30분 정도 굳히세요. 플레이트가 굳어지는 동안 손상되지 않도록 주의하세요.
8. 고체화되면 오버레이 위에 2-5μl 상청액을 발라. 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 부양시키세요. 다음 날 아침 결과를 관찰하고 기록하세요.
   메모: 상청액을 연속적으로 희석하는 검사를 하여 검사하는 것이 유용할 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 박테리오파지와 박테리오신 제거 활성을 구분할 수 있습니다. 이 경우 1:5 또는 1:10 희석을 권장합니다.

재료