단일 콜로니 선택을 통한 스트레스 적응 박테리아의 분리

초록

출처: 정 H. 외 화학정기를 이용한 미생물의 적응적 실험실 진화 절차. J. Vis. 경험 (2016).

이 영상은 장기간 스트레스 환경에 노출된 배양에서 스트레스에 적응한 박테리아가 선택적으로 분리되고 성장하는 과정을 보여줍니다. 배양물은 스트레스 요인 함유 한천 위에 플레이트링되며, 단일 콜로니가 선택되어 스트레스 물질을 액체 배지에 접종합니다. 흡수율은 성장 상태를 모니터링하고 스트레스에 적응한 박테리아의 성공적인 분리를 확인하기 위해 정기적으로 측정됩니다.

프로토콜

1. 장비 준비

1. 흡입구와 출구 포트가 있는 케모스타트 병(150-250 ml)이나 얼렌마이어 플라스크(250 ml)를 준비하세요. 포트를 실리콘 튜브로 연결하면 10-100 ml/hr의 유량을 제공합니다. 선택적으로 공기 통풍구, 공기 배출구, 온도 조절 가능한 물 입구 및 배출구를 사용할 수 있습니다.
2. 화학정기 병에 적합한 교반 및 온도 조절 장치를 구하거나 회전식 흔들기 인큐베이터를 사용하세요.
3. 신선한 배지를 공급하고 배양물을 채취하기 위해 연동 펌프 두 대를 확보하세요.
4. 중간 출구 포트와 공기 입구 포트가 포함된 저장소 병(10-20L)을 확보하세요.
5. 희석 속도에 적합한 실리콘 튜빙(예: 내증 0.8 mm, 유량 범위 0.06-36 ml/min; L/S 13 튜빙).

2. 미디엄 준비 및 멸균

1. 초기 매체
   1. 0.3 g 포도당, 0.08 g 염화암모늄(NH₄Cl), 0.05 g 염화나트륨(NaCl), 0.75g 인산수소 이물산(Na₂HPO₄·2H₂O), 0.3 g 인산수소나트륨 이하이드레이트(KH₂PO₄)를 90 mL 증류수(D.W.)에 화학기 조절기 병에 녹인다.
   2. 케모스타트 병과 튜브를 클램프로 밀봉하세요. 공기 통풍구를 막지 마세요.
   3. 케모스탯 병을 121°C의 오토클레이브에서 15분간 멸균하세요. 멸균 후에는 케모스타트 병을 실온에 보관하세요.
   4. 황산마그네슘 7수화물 0.02g(MgSO₄·7H₂O), 0.01g 염화칼슘(CaCl₂), 티아민 0.1mg을 10 mL D.W.(용액 A)에 녹인다.
   5. 주사기와 사전 멸균된 주사기 필터(0.45 μm 포어 필터)를 사용한 필터 용액 A.
   6. 용액 A 여과액을 케모스타트 병에 넣으세요.
2. 응력 매체
   1. 30g 포도당, 8g NH₄Cl, 5g NaCl, 75g Na₂HPO₄·_{2 O,}30g KH₂PO₄, 300g 디우크슘 석시네이트 육수화물(Na₂·석시네이트·6H₂O; 이 실험에서 사용된 스트레스 요인)을 9.9 L D.W.에 용해시킵니다.
   2. 저수지 병과 튜브를 클램프로 밀봉하세요. 공기 통풍구를 막지 마세요.
   3. 저장소 병을 121°C에서 오토클레이브에서 15분간 소독하세요. 멸균 후에는 병을 실온에 보관하세요.
   4. 2g MgSO₄·7H_2O, 1g_CaCl2, 10mg 티아민을 100ml D.W.(용액 A)에 녹입니다.
   5. 필터 용액 A에 주사기와 미리 멸균된 주사기 필터(0.45 μm 기공 필터)가 장착되어 있습니다.
   6. 용액 A 여과물을 저장소 병에 추가하세요.
   7. 멸균된 실리콘 튜브를 저수지 병에 무호흡으로 연결하고 연동 펌프를 연결하세요.
3. 고스트레스 매체
   1. 2.2절과 같이 배지를 준비하되, 스트레스 요인 농도가 더 높게(즉, 숙시네이트 적응에서 3-5 g/L 증가)로 만듭니다.
      참고: 이 프로토콜은 매체를 통해 전달될 수 있는 스트레스에 적응하기 위한 것입니다. 온도, 교란, 조명과 같은 물리적 스트레스 요인의 경우, 재배 방식은 이에 맞게 설계되어야 합니다.

3. 초기 재배

1. 15ml 시험관에 4ml의 초기 배지를 넣고 야생형 대장균(E. coli) 단일 군락을 접종합니다.
2. 시험관을 37°C, 220rpm에서 12시간 동안 진동 인큐베이터에서 배양하세요.
3. 무균적으로 1ml의 전문화 분량을 케모스타트 병에 옮깁니다.
4. 케모스타트 병을 37°C에서 6시간 동안 산소(공기 50ml/분)와 교반(200rpm)을 제공하는 인큐베이션을 합니다.

4. 스트레스 적응

1. 펌프에서 실리콘 튜브 끝을 케모스타트 병에 무균으로 연결하세요.
2. 출구 펌프(시간당 10ml) 이상을 가동하고 배양을 채취하세요. 참고: 배양은 보통 초기 배양 후 4-8시간 내에 기초급수적으로 진행되어야 합니다.
3. 출구 배양관에서 나오는 배양물의 광학 밀도(600 nm)를 확인하세요.
4. 흡입 펌프를 가동하세요(시간당 10ml, 희석율 0.1-1에 해당).
5. 출구 튜브에서 600nm 배양 배양 밀도를 24시간마다 확인하세요.
6. 케모스터터를 96시간(9.6배 회전) 이상 작동하세요. 광학 밀도가 안정적이라면 고응력 매질을 포함하는 저장소를 교환합니다. 광학 밀도가 0.2 미만이면 6시간 동안 공급 입구 펌프를 멈추세요. 흡입 펌프를 재가동하고 광학 밀도가 0.2를 넘는지 확인하세요.
7. 스트레스 요인의 농도를 점차 높여 더 높은 스트레스 농도를 가진 저장소로 바꾸세요.
8. 적응된 배양균이 마일스톤에 도달할 때(예: 100 g/L 숙시네이트 스트레스에 적응한 균주) 샘플을 채취하여 추가 유전체 분석을 위해 보관하세요.
9. 샘플 저장을 위해 배양 샘플(0.5ml)을 멸균된 80% 글리세롤 용액(0.5ml)과 혼합하여 -80 °C에서 보관하세요. 참고: 미생물이 ALE 과정에서 스트레스 요인을 분해할 수 있는 능력을 획득하면, 발효 병 내 스트레스 물질 농도는 신선한 저장소의 농도와 같지 않습니다.

5. 스트레스 적응 균주의 단일 군집 분리

1. 동일한 스트레스 요인과 같은 농도의 한천 배지를 준비합니다.
2. 케모스타트에서 배출 배양액(0.1ml)을 플레이트링하고, 37°C에서 16시간 배양합니다.
3. 멸균 이쑤시개로 플레이트에서 단일 콜로니를 골라내어 케모스타트와 같은 스트레스 요인과 중간 농도의 15ml 시험관에 접종한 후 6시간 배양합니다.
4. 배양 육수 1ml를 50ml 배지를 담은 250ml Erlenmeyer 플라스크에 옮깁니다. 1시간마다 0.5ml의 배양 육수를 수확하고, 600 nm에서 O.D.를 측정합니다. 스트레스 요인이 있을 때 적응형 균주와 야생형 균주의 성장 속도를 비교해 보십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미니 케모스타트 발효기	바이오트론 주식회사	-	특별 주문으로 제작됨
실리콘 튜빙	콜-파머	마스터플렉스 L/S 13	튜빙 크기는 희석 속도와 발효기 병 크기에 따라 조절할 수 있습니다.
저수지 병	벨코	미디어 저장 병	20 L
화학 물질	시그마-올드리치	-	시약 등급
포도당	시그마-올드리치	G5767	ACS 시약
NH₄Cl	시그마-올드리치	A9434	분자생물학, 세포 배양 적합, ≥99.5%
나클	시그마-올드리치	746398	ACS 시약, ≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	시그마-올드리치	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	시그마-올드리치	795488	ACS 시약, ≥99%
MgSO₄·7H₂O	시그마-올드리치	230391	ACS 시약, ≥98%
CaCl₂	시그마-올드리치	793639	ACS 시약, ≥96%
티아민·HCl	시그마-올드리치	T4625	시약 등급, ≥99%
Na₂succinate·6H₂O	시그마-올드리치	S2378	ReagentPlus, ≥99%