오염물질 분해 균주를 분리하기 위한 해양 박테리아 선별

초록

출처: 빌렐라, H. D. M. 외 생물 복원을 위한 미생물 균주 탐사 및 형생물 연구 및 보존을 위한 프로바이오틱스 개발. J. Vis. 경험 (2019).

이 영상은 EE2 함유 배지에서 연속 희석, 군집 선택, 성장을 통해 오염물질 분해 해양 박테리아를 분리하는 과정을 보여줍니다. EE2를 유일한 탄소원으로 사용하여 이 환경 오염물질을 대사할 수 있는 박테리아 균주를 식별합니다.

프로토콜

1. 미생물 격리를 위한 물 및 산호 수집 및 저장

메모: 샘플링 지점의 좌표와 온도를 측정하는 것이 필수적입니다. 가능하다면, 염분, pH, 깊이, 빛 세기와 같은 메타데이터도 미세 재배 접근법과 미래 데이터 해석에 도움이 될 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 위해서는 샘플을 가능한 최소한의 시간 동안 보관하세요. 샘플이 적절한 온도에 보관되지 않거나 장기간 보관되면 수/산호 미생물군이 크게 변할 수 있습니다. 채집 직후 즉시 분리 단계가 이루어지지 않을 경우, 처리 전까지 샘플을 4 °C로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 샘플이 4 °C에서도 보관 기간이 길어질수록 미생물 군집은 더 크게 변합니다.

1. 바닷물을 샘플링하고 보관하세요.
   1. 각 목표 샘플링 지점에서 최소 3배로 500mL 이상의 물 샘플을 채취하세요. 가능하면 나사 캡이 달린 멸균 병을 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 물을 수집 즉시 처리할 경우, 병을 짧은 시간 동안 RT에 보관하세요. 샘플 처리가 나중에 이루어진다면 병을 4 °C로 유지하세요.
2. 산호를 샘플링하고 보관하세요.
   1. 멸균된 펜치를 사용해 수질 샘플 채취 지점에서 산호 조각을 자르세요. 오염을 피하려면 멸균 장갑을 끼고 산호만 만져야 합니다.
   2. 샘플링한 산호 조각은 20mL 멸균 식염수(증류수 내 3% NaCl) 또는 인공 바닷물로 헹구어 바닷물에 느슨하게 붙어 있는 자유 생활 박테리아를 제거합니다.
   3. 각각의 산호 조각을 무균 식염수 용액이 담긴 나사 캡이 있는 멸균된 250−500 mL 용기에 넣습니다.
   4. 실험실에서는 멸균 겸자와 펜치를 사용해 멸균된 100mm x 20mm 페트리 접시를 무게 저울에 올려 산호 조각 5g을 무게를 재습니다.
   5. 5g의 산호 샘플을 멸균 절구에 옮기고 멸균 페스트로 분쇄합니다.
   6. 멸균 주걱을 사용해 마세리팅된 샘플을 3% NaCl 멸균 용액 45mL와 5mm 10⁻¹5 유리 구슬이 들어있는 멸균 배양 플라스크에 옮깁니다. 45mL 멸균 식염수 용액을 사용해 모르타르를 세척하고 마세레이트의 최대 양을 회수하세요.
   7. 샘플 채취 지점의 수온에서 16시간 동안 플라스크를 지속적으로 교반(150 x g)으로 유지하세요.
      메모: 얕은 수역 산호의 경우 최적 온도는 24−28 °C 사이입니다. 이 단계는 숙주 세포에 부착된 미생물이나 조직과 골격 내에 사는 산호 구획 등 다양한 산호 구획에서 미생물을 분리시킵니다. 이 단계 이후에는 산호 마세레이트를 저장하지 않아야 하며, 격리 단계는 즉시 수행해야 합니다.

2. 바닷물 및/또는 산호에서 합성 에스트로겐 17a-에티닐레스트라디올(EE2) 분해성 박테리아 분리

1. 박테리아를 선택하세요.
   메모: 1.1.2 및 1.2.7 단계 이후에는 다양한 산호 마세레이트에서 분리된 해수 내 미생물 농도가 알려지지 않았으며 변동성이 있습니다. 한천 배지를 포함한 페트리 접시에서 개별 미생물 집락을 분리하기 위해서는 연속적인 희석이 필요합니다.
   1. 산호 샘플은 멸균 식염수에서 최대 10-9%까지, 수질 샘플은 최대 10-6%까지 연속 희석을 수행합니다. 피펫으로 5번 희석한 후 팁을 버립니다. 다음 연속 희석을 수행하기 전에 매번 5초간 보텍스를 샘플링합니다.
   2. 3% NaCl 용동성 육수(LB) 한천 배지를 포함한 페트리 접시에 희석액 100 μL을 피펫 채취하여 플레이트를 부착합니다.
      메모: 대체 배지로 해양 한천(MA)을 사용하세요. 신뢰할 수 있는 결과를 위해서는 각 희석액의 3배가 필요합니다.
   3. 플레이트를 목표 온도(예: 26 °C)에서 1⁻3일간 배양합니다. 하루에 한 번 번호판을 확인하세요.
   4. 새로운 판에서 뚜렷한 성장 형태를 보이는 집단을 선별하여 줄무늬판 기법을 사용합니다. 이 과정을 필요한 만큼 반복하여 순수한 군락이 플레이트에 자라도록 합니다.
   5. 절차가 즉시 2.3.1단계로 이어지지 않을 경우, 분리물을 4°C 또는 2.2절에 설명된 글리세롤에 보관하십시오.
2. 글리세롤 스톡을 준비하세요.
   메모: 이 단계는 선택 사항이며 장기 박테리아 저장에 사용할 수 있습니다.
   1. 신선한 배지나 4°C에 보관된 배지에서 단일 군락을 골라 2mL의 멸균 LB 배지에 독립적으로 접종합니다.
   2. 튜브를 24−28 °C에서 하룻밤 동안 지속적으로 교반(150 x g)에 둡니다.
   3. 2.2.2단계에서 추출한 박테리아 배양 1mL와 멸균 글리세롤을 최종 농도인 20%로 2mL 크라이오비알에 첨가합니다.
   4. 냉동통은 4°C에서 켜두세요.
   5. 글리세롤 박테리아 스톡은 필요할 때까지 -80 °C에 보관하세요.
3. EE2 열화 능력 검사를 수행하세요.
   1. LB 육수나 대체 배지에서 분리물을 활성화하세요. 이를 위해 신선한 플레이트 또는 4°C에 보관된 플레이트에서 단일 콜로니를 골라 멸균 LB 배지 2mL를 접종합니다. 글리세롤 스톡이라면 먼저 LB 한천 플레이트에 스트레이크한 후 24−28 °C 온에서 배양하여 단일 군락이 성장하도록 합니다. LB 배지를 담은 튜브를 24−28 °C 온도에서 지속적으로 교반(150 x g)하여 기울여 놓습니다.
   2. 박테리아가 성장한 후, 세포를 8,000 x g 에서 실온(RT)에서 8분간 원심분리하여 펠릿을 넣습니다. 상원액을 버리고 부드럽게 위아래로 피펫팅한 뒤, 세포를 같은 부피(2 mL)의 식염수에 다시 부탁하여 남은 LB 육수를 씻어냅니다.
   3. 탄소 원천의 흔적이 없도록 2.3.2 단계를 두 번 반복하고, 세포를 같은 부피의 식염수 용액에 재현탁시킵니다. 예를 들어, 2 mL 배양으로 시작했다면, 세포를 최종 용량의 2 mL 식염수 용액에 재현탁합니다.
   4. 세척 및 재현탁된 세포는 EE2를 유일한 탄소원으로 포함하는 최소한의 Bushnell Haas 배양 배양지(BH Broth)에 접종합니다.
      메모: EE2는 배양지에서 최종 농도가 5 mg/L로 에탄올에 용해됩니다. 필요하다면 오염물질 종류나 농도를 변경하세요.
   5. 600nm 광밀도 및/또는 LB 한천 배지에서 콜로니 형성 단위(CFU)를 이용한 박테리아 성장을 16−72시간 동안 평가합니다.
      메모: 또는 EE2 또는 기타 화합물이 유일한 탄소원으로 포함된 최소 배지에서 직접 분리할 수도 있습니다. 이 단계는 선발을 지시하고 바람직하지 않은 성장을 방지할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
500 mL PYREX 미디어 저장 병	토마스 사이언티픽/코닝	1743E20/1395-500	물을 샘플링하는 데 사용되었습니다.
500 mL 흡인 병	토마스 사이언티픽/코닝	1234B28/1220-2X	기름 분획을 분리하는 데 사용되었습니다.
6인치 와이어 커터 플라이어	토마스 사이언티픽/레스테크	1173Y64/23033	산호 조각을 자르는 데 사용되었습니다.
17a-에티닐레스트라디올	LGC 표준	드레-C13245100	선택적 배지를 만드는 유일한 탄소원으로 사용되었습니다.
아가르	히미디어	PCT0901-1KG	고체 매체를 만들곤 했어요.
부시넬 하스 브로스	히미디어	M350-500G	탄소원으로 보충되는 최소 매체로 사용됩니다.
에를렌마이어 플라스크	토마스 사이언티픽/DWK 생명과학 (킴블)	4882H35/26500-125	산호를 유리 구슬과 함께 분양하는 데 사용되었습니다.
루리아 베르타니 육수, 밀러 (밀러 루리아 베르타니 육수)	히미디어	M1245-1KG	박테리아를 키우는 풍부한 배지로 사용되었습니다.
마린 아가르 2216 (조벨 마린 아가르)	히미디어	M384-500G	박테리아를 키우는 풍부한 배지로 사용되었습니다.
궤도 셰이커 인큐베이터			액체 배지와 오일을 배양하는 데 사용되었습니다.
플레이트 인큐베이터			플레이트를 부화시키는 데 사용했어요.
도자기 절구와 공약	토마스 사이언티픽/유나이티드 사이언티픽 보급품	1201U69/JMD150	산호 조각을 절삭하는 데 사용되었습니다.
큐비트 2.0 형광도계	인비트로젠		DNA 및 PCR 산물의 핵산 정량에 사용됩니다.
냉장 원심분리기			박테리아 배양 원심분리에 사용되었습니다.
분광광도계			박테리아 배양물의 광학 밀도를 측정하는 데 사용되었습니다.