해수 샘플에서 오일 분해성 해양 박테리아의 선택적 농축 및 분리

초록

출처: 빌렐라, H. D. M. 외 생물 복원을 위한 미생물 균주 탐사 및 형생물 연구 및 보존을 위한 프로바이오틱스 개발. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 해수 샘플을 유성 배지에 농축하여 선별적으로 분리하는 과정을 시연하며, 순수 균주를 회수하고 원유 생물복원과 환경 정화에 잠재적으로 활용할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 미생물 격리를 위한 물과 산호 수집 및 저장

메모: 샘플링 지점의 좌표와 온도를 측정하는 것이 필수적입니다. 가능하다면, 염분, pH, 깊이, 빛 세기와 같은 메타데이터도 미세 재배 접근법과 미래 데이터 해석에 도움이 될 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 위해서는 샘플을 가능한 최소한의 시간 동안 보관하세요. 샘플이 적절한 온도에 보관되지 않거나 장기간 보관되면 수/산호 미생물군이 크게 변할 수 있습니다. 채집 직후 즉시 분리 단계가 이루어지지 않을 경우, 처리 전까지 샘플을 4 °C로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 샘플이 4 °C에서도 보관 기간이 길어질수록 미생물 군집은 더 크게 변합니다.

1. 바닷물을 샘플링하고 보관하세요.
   1. 각 목표 샘플링 지점에서 최소 3배로 500mL의 물 샘플을 채취하세요. 가능하면 나사 뚜껑이 달린 멸균 병을 사용하세요.
   2. 물을 수집 직후 즉시 처리할 경우, 병을 RT(실온)에 잠시 보관하세요. 샘플 처리가 나중에 이루어진다면 병을 4 °C로 유지하세요.
2. 산호를 샘플링하고 보관하세요.
   1. 멸균된 펜치를 사용해 수질 샘플과 같은 샘플링 지점에서 산호 조각을 잘라내세요. 오염을 피하려면 멸균 장갑을 끼고 산호만 만져야 합니다.
   2. 샘플링한 산호 조각은 20mL 멸균 식염수(증류수 내 3% NaCl(염화나트륨) 또는 인공 바닷물로 헹구어 바닷물에 느슨하게 붙어 있는 자유 생활 박테리아를 제거합니다.
   3. 각각의 산호 조각을 무균 식염수 용액이 담긴 나사 캡이 있는 멸균된 250−500 mL 용기에 넣습니다.
   4. 실험실에서는 멸균 겸자와 펜치를 사용해 멸균된 100mm x 20mm 페트리 접시를 무게 저울에 올려 산호 조각 5g을 무게를 재습니다.
   5. 5g의 산호 샘플을 멸균 절구에 옮기고 멸균 페스트로 분쇄합니다.
   6. 멸균 주걱을 사용해 마세리팅된 샘플을 3% NaCl 멸균 용액 45mL와 5mm 10⁻¹5 유리 구슬이 들어있는 멸균 배양 플라스크에 옮깁니다. 45mL 멸균 식염수 용액을 사용해 모르타르를 세척하고 마세레이트의 최대 양을 회수하세요.
   7. 샘플 채취 지점의 수온에서 16시간 동안 플라스크를 지속적으로 교반(150 x g)으로 유지하세요.
      메모: 얕은 수역의 산호의 경우 최적 온도는 24−28°C 사이입니다. 이 단계는 숙주 세포에 부착된 미생물이나 조직과 골격 내에 사는 산호 구획 등 다양한 산호 구획에서 미생물을 분리시킵니다. 이 단계 이후에는 산호 마세레이트를 저장하지 않아야 하며, 격리 단계는 즉시 수행해야 합니다.

2. 바닷물 및/또는 산호에서 오일 분해성 박테리아 분리

1. 유수용성 분획(oWSF)과 유수성 불용성 분획(oWIF)을 유일한 탄소원으로 포함하는 최소 배지를 준비합니다.
   1. 멸균 증류수 500mL에 원유 1⁻²%를 첨가합니다. 필터 플라스크를 바닥에 열어 불용성 분획의 상층을 건드리지 않고 용해성 분획을 제거하세요.
   2. 혼합물을 24−28 °C에서 150 x g 에서 48시간 동안 지속적으로 저어줍니다.
   3. 원유 분획이 담긴 필터 플라스크를 안정적인 표면에 놓고 10−20분간 기다려 용해성 분획과 불용성 분획 분리를 기다립니다.
   4. oWSF를 새 멸균 플라스크로 옮기고, 아래쪽 필터 플라스크를 열고 용해성 분획을 제거하여 oWIF를 보존하세요.
   5. 이전 단계에서 회수한 모든 oWSF(~400 mL)를 사용하여, oWSF를 유일한 탄소원으로 포함하는 BH(Bushnell Haas) 한천 최소 배지 1L을 준비합니다.
   6. 2.1.4단계에서 플라스크에 남아 있는 oWIF를 사용해, oWIF를 유일한 탄소원으로 포함하는 최소 배지 1L의 BH 한천을 준비합니다.
2. oWSF 및 oWIF를 분해하는 박테리아를 분리합니다.
   1. 1.1.2 및 1.2.7 단계의 물과 산호 마세레이트를 사용하여, 아래와 같이 멸균 염수 용액에 샘플을 최대 ^10-6 까지 희석합니다.
3. 산호 샘플은 멸균 식염수에서 최대 ^10-9 %까지, 수질 샘플은 최대 ^10-6 %까지 연속 희석을 수행합니다. 피펫으로 5번 희석한 후 팁을 버립니다. 다음 연속 희석을 수행하기 전에 매번 5초간 보텍스를 샘플링합니다.
4. BH-oWSF와 BH-oWIF 한천 배지를 포함한 페트리 접시에 희석액 100 μL을 피펫 채우고 플레이트를 만듭니다.
5. 플레이트를 목표 온도(예: 26 °C)에서 1⁻3일간 배양합니다. 하루에 한 번 번호판을 확인하세요.
6. 새로운 판에서 뚜렷한 성장 형태를 보이는 집단을 선별하여 줄무늬판 기법을 사용합니다. 이 과정을 필요한 만큼 반복하여 순수한 군락이 플레이트에 자라도록 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
500 mL PYREX 미디어 저장 병	토마스 사이언티픽/코닝	1743E20/1395-500	물을 샘플링하는 데 사용되었습니다.
500 mL 흡인 병	토마스 사이언티픽/코닝	1234B28/1220-2X	기름 분획을 분리하는 데 사용되었습니다.
6인치 와이어 커터 플라이어	토마스 사이언티픽/레스테크	1173Y64/23033	산호 조각을 자르는 데 사용되었습니다.
아가르	히미디어	PCT0901-1KG	고체 매체를 만들곤 했어요.
부시넬 하스 브로스	히미디어	M350-500G	탄소원으로 보충되는 최소 매체로 사용됩니다.
에를렌마이어 플라스크	토마스 사이언티픽/DWK 생명과학 (킴블)	4882H35/26500-125	산호를 유리 구슬과 함께 분양하는 데 사용되었습니다.
층류 후드			멸균된 환경에서 일해야 했어요.
루리아 베르타니 육수, 밀러 (밀러 루리아 베르타니 육수)	히미디어	M1245-1KG	박테리아를 키우는 풍부한 배지로 사용되었습니다.
마린 아가르 2216 (조벨 마린 아가르)	히미디어	M384-500G	박테리아를 키우는 풍부한 배지로 사용되었습니다.
궤도 셰이커 인큐베이터			액체 배지와 오일을 배양하는 데 사용되었습니다.
플레이트 인큐베이터			플레이트를 부화시키는 데 사용했어요.
도자기 절구와 공약	토마스 사이언티픽/유나이티드 사이언티픽 보급품	1201U69/JMD150	산호 조각을 절삭하는 데 사용되었습니다.
냉장 원심분리기			박테리아 배양 원심분리에 사용되었습니다.
분광광도계			박테리아 배양물의 광학 밀도를 측정하는 데 사용되었습니다.
위저드 유전체 DNA 정화 키트	프로메가	A1120	미생물 균주 DNA 추출에 사용됩니다.