마이크로플루이딕 시스템에서 단일 세포 해상도로 박테리아 성장 추적

초록

출처: 케이빈, M. T. 외 Bacillus subtilis의 단세포 미세유체 분석. J. Vis. Exp. (2018)

이 영상은 단일 세포 수준에서 박테리아 성장을 관찰하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 이 연구는 미세한 도랑 내에 갇힌 비운동성 박테리아 세포가 형광 현미경 아래에서 지속적으로 영양을 공급받고 영상화되는 과정을 보여줍니다. 이 장치는 여러 세대에 걸친 세포 분열 및 계통 추적의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. PDMS 장치 캐스팅

1. 먼지 없는 환경에서 폴리디메틸실록산(PDMS) 폴리머와 경화제를 10:1 비율로 혼합한 후 최소 10분간 진공 상태에서 탈기를 합니다.
2. 실리콘 마스터(또는 그 복제본)를 깨지지 않은 알루미늄 호일 위에 폴리스티렌 페트리 플레이트에 올려놓으세요. 탈기된 PDMS 혼합물을 마스터 위에 약 5mm 깊이까지 부어줍니다. 페트리 플레이트를 최소 10분 이상 제거하세요. 표면의 기포를 부드럽게 불어넣어 깨뜨리세요.
   메모: 플라스틱 복제 마스터는 탈기 중에 부분적으로 떠 있을 수 있습니다; 이럴 때는 깨끗한 플라스틱 어플리케이터로 복제품을 눌러주세요.
3. PDMS를 60°C에서 오븐에서 최소 1시간 이상 경화시키고 실온까지 식힙니다. 마스터와 경화된 PDMS를 들어 있는 알루미늄 호일을 페트리 플레이트에서 제거하세요. 마스터 뒷면의 알루미늄 호일을 조심스럽게 떼어내고, PDMS도 조심스럽게 떼어내세요.
   메모: 또는 PDMS는 상온에서 하룻밤 경화될 수 있습니다. 실리콘-웨이퍼 마스터의 상대적 취약성은 에폭시 접착제를 사용해 웨이퍼와 같은 크기의 1/16인치 두께 알루미늄 디스크에 웨이퍼를 영구적으로 접착함으로써 극복할 수 있습니다.
4. 웨이퍼에는 일반적으로 크기가 약간 다른 여러 개의 마이크로플루이딕 장치가 포함되어 있으므로, 깨끗하고 날카로운 메스로 하나의 장치를 크기에 맞게 절단합니다.
   메모: 일상적인 Bacillus subtilis 작업에는 폭 1.0 μm 세포 트렌치를 가진 장치를 사용하세요.

2. 장치 천공 및 접합

1. 패턴이 있는 면에 반투명 사무용 테이프 (재료표 참조)를 붙여 패턴 특징의 가시성을 높이세요. 입구와 출구 포트는 가시적인 유체 채널의 반대편 끝에 위치한 원형 영역으로 식별됩니다(그림 1). 흡입 및 출구 핀 구멍을 뚫을 때 시야를 높이기 위해, 고운 팁 마커로 입구와 출구에 점으로 표시하세요.
   메모: 입구와 출구 핀이 빽빽하지 않도록 하기 위해, 장치의 알파벳 지정자 바로 아래 채널부터 시작하여 다른 모든 채널을 펀칭합니다.
2. PDMS 장치를 뒤집어 패턴이 있는 면이 아래로 향하게 하고, 0.75mm 생검 펀치로 표시된 점들을 뚫어 보입니다; 주먹질은 버려.
   메모: 이 장치는 패턴이 있는 면이 아래로 향하도록 펀칭되는데, 이는 생검 펀치가 고분자에 들어가는 구멍이 보통 약간 벌어져 있기 때문입니다. 장치를 거꾸로 펀칭하면 패턴이 있는 쪽의 구멍에 뚜렷한 테두리가 생깁니다.
3. 입체현미경을 사용해 천공 구멍이 장치의 입구 및 출구 영역과 겹치도록 하세요. 구멍에 남은 PDMS 조각을 제거하기 위해 가는 핀셋을 사용하세요.
4. 접착제 테이프로 기기 양쪽의 먼지를 제거하고 깨끗한 폴리스티렌 페트리 플레이트에 넣으세요. 22mm x 40mm 크기의 커버 유리를 100% 이소프로필 알코올로 적시고 클린룸 물티슈로 문지르세요; 먼지 없는 공기 흐름이나 질소로 건조하세요.
5. 천공된 PDMS 장치 기능을 깨끗이 닦은 덮개 유리와 함께 산소 플라즈마 클리너에 눕히세요.
   1. 플라즈마 처리를 다음 설정으로 처리하세요: 진공 70 mTorr; 산소 압력 200 mTorr; 촬영 시간 15초; 출력, 30W. 플라즈마 처리 기간이 끝나자마자 장치를 제거하고 플라즈마 클리너의 유리를 덮으세요.
   2. PDMS를 뒤집어 덮개 유리 중앙에 놓아 패턴이 있는 면이 유리와 접촉하도록 합니다; 입구와 출구 구역 사이를 잇는 공급 채널이 커버 유리의 긴 축과 정렬되어 있는지 확인하세요. PDMS가 유리에 잘 밀착되도록 아주 부드럽게 눌러보세요.
6. 조립된 장치를 오븐에서 최소 1시간 이상 60°C에서 구워 주세요. 베이킹 후에는 PDMS가 유리에 접착되었는지 장치의 한쪽 모서리를 부드럽게 눌러 수동으로 확인하세요.
   메모: 기기가 접지되면 24시간 이내에 사용해야 하며, 플라즈마 처리 후 시간이 지날수록 고분자가 점점 더 소수성으로 변할 것입니다.

3. 마이크로플루이딕 배관 준비

1. 폴리머 튜브(내경(ID) 0.02인치, 외경(OD) 0.06인치)의 길이를 주사기 펌프에서 스위치 장치(사용 시)와 현미경에 장착할 때 장치에 닿을 수 있도록 적절한 길이로 절단합니다. 마이크로플루이딕 레인 수만큼 길이를 절단하세요.
2. 핀치 밸브용 Y자 접합부(사용 중)는 'Y' 상단 바브에 2cm 길이의 유연한 실리콘 튜브(내경 0.03인치, 외경 0.065인치)를, 'Y' 하단 바브에 1cm 길이의 실리콘 튜브를 절단하여 부착하여 조립합니다.
3. 10cm(또는 적절한) 길이의 폴리머 튜브를 절단합니다; 한쪽 끝에서 스위치 접합부에 연결하여 'Y' 하단 바브의 1cm 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입하세요. 반대쪽 끝에서 플라스틱 주사기 어댑터에서 분리한 21G 바늘에 연결하고, 바늘 끝에서 약 90°, 약 9mm 정도 구부러진 것입니다.
4. 21G 둔한 바늘을 주사기에서 스위치 장치로 이어지는 튜빙 세그먼트의 한쪽 끝에 바늘을 튜빙에 꽂아 연결하세요. 각 길이의 튜브 나머지 끝을 Y 접합부의 입구 가시에 있는 실리콘 튜브 구간에 삽입하세요.
   메모: 핀치 밸브와 접합부를 고정하는 장치를 사용하세요; 이는 마이크로피펫 팁 박스(그림 2D)에서 쉽게 만들 수 있습니다.
5. 기기 출구에서 폐기물을 비커로 운반할 수 있도록 폴리머 튜브를 잘라내세요. 한쪽 끝에서 위에서 설명한 대로 구부러진 21G 바늘에 연결하세요. 튜브의 다른 쪽 끝을 폐기물 비커에 테이프로 붙이세요.
6. 0.1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 적절한 양의 배지를 준비하고, 원하는 크기와 주사기 수를 채웁니다. BSA 주사기를 입구 튜브에 부착된 준비된 21G 바늘에 연결하고, 주사기를 주사기 펌프에 주입합니다.
   메모: 일반적인 실험에서는 5개의 채널이 사용되며, 각 채널에는 20mL 주사기가 사용됩니다. 배지를 바꾸는 실험은 각각 5개의 주사기 뱅크 2개가 필요합니다. 여기서 첫 번째 뱅크를 포함하는 펌프를 1단계 펌프라고 하며, 두 번째 뱅크를 포함하는 펌프와 스위치 후 매질을 가진 펌프를 2단계 펌프라고 합니다.
7. 주사기 펌프를 높은 유량(>500 μL/min)으로 돌려 흡입구 배관의 공기를 정화하세요. 먼저 주사기 펌프를 수직으로 정렬하고 주사기를 두드려 공기 방울을 위로 끌어올립니다. 주사기에서 공기가 제거된 후에는 주사기 펌프를 수평으로 놓고 주사기에서 스위치 장치를 따라 고분자 라인을 점진적으로 두드리거나 튕기며 공기 방울을 제거하고 정화합니다. 이 과정을 두 번째 주사기 뱅크(매체를 전환할 경우)에도 반복하세요.
8. 공기 방울이 제거된 후, 2상 주사기 펌프(즉, 스위치 후 두 번째로 사용할 배지를 포함)를 1.5 μL/min으로 설정한 후 흐름을 일시정지합니다. 두 번째 중간 단계에 해당하는 Y자 접합부의 유연한 튜빙 구간에 작은 바인더 클립을 끼웁니다. Phase 1 주사기 펌프를 최소 30분 동안 적당한 유량(예: 분당 10 μL)으로 계속 가동하여 Y 접합부 하류의 입구 튜빙에서 두 번째 매체를 제거하세요.

4. 세포 배양 준비

1. 원하는 배지에서 관심 균주를 하룻밤 사이에 정지기까지 재배합니다. 박테리아 균주에는 세포가 움직이지 못하게 하는 돌연변이가 있어야 하며, 세포가 장치의 채널을 빠져나가지 못하게 합니다.
   메모: 이 프로토콜에서 박테리아 균주는 B. subtilis 3610으로, hagA233V 치환(이 돌연변이로 인해 편모가 나선형이 아닌 곧게 되어 세포 운동성을 방해함), 세포 스트레스에 대한 PrsbV-mNeonGreen 리포터, 그리고 세포를 강조하는 구성적 Phyperspank-mNeptune(빨간색) 리포터가 포함되어 있습니다. 예시 프로토콜에는 루리아-베르타니(LB) 레녹스 배지가 사용되었습니다. 마이크로플루이딕스 실험의 일반적인 균주는 하나 이상의 형광 전사 리포터와 세포의 자동 검출을 용이하게 하기 위해 지속적으로 생성되는 세포질 형광 단백질을 포함합니다. LB Lennox 풍부한 배지를 사용할 때는 성장 결함이 관찰되지 않았으나, 최소 배지에서 B. subtilis 의 성장은 미세유체 조건에서 분비된 시선포어가 배지 흐름에 의해 씻겨 나가면서 억제될 수 있습니다. 이러한 상황에서는 S750 배지에 보고된 바와 같이 시트레이트나트륨과 염화철을 배지에 첨가하여 성장을 회복시킬 수 있습니다.
2. 실험 당일 아침, B. subtilis 세포를 250mL 배지 배지를 담은 배플링 플라스크에 1:50으로 희석합니다. 세포를 37°C에서 5-6시간 동안 진동 배양하여 광학 밀도가 1을 초과하도록 배양합니다.
   메모: 조밀한 세포 배양이 바람직한데, 고정상 B. subtilis 세포는 더 작고 세포 사슬에서 더 자주 발견되지 않아 장치 부하가 용이하기 때문입니다. 박테리아 종에 따라 최적의 적재를 위해 다른 배지나 성장 조건이 필요할 수 있습니다.
3. 5 μm 기공 크기 필터가 장착된 주사기를 사용해 약 15mL의 세포 배양물을 15mL 원뿔 튜브에 걸러내어 B. subtilis 세포 사슬을 제거합니다( 대장균 에는 필요하지 않으며 다른 종에서는 필요하지 않을 수 있습니다).
   메모: 상대적으로 적은 세포를 제거해야 하며; 여과액은 탁해야 합니다.
4. 여과된 배양물을 실온에서 4,000 x g에서 10분간 원심분리합니다. 상정액을 부어 튜브 내에 남아 있는 잔류 상정액에 세포 펠릿을 다시 부유시키며, 필요 시 약 500 μL의 신선한 배지를 추가하여 세포 현탁액을 피펫팅하기 쉽게 합니다.

5. 장치 적재

1. 빈 얇은 젤 로딩 마이크로피펫 팁 (재료표 참조)을 마이크로플루이딕 장치의 출구에 부드럽게 넣습니다.
2. P200 마이크로피펫과 함께 얇은 젤 로딩 팁을 사용하고, 1 mg/mL BSA가 포함된 배지를 입구 구멍에 주입하여 장치를 수동화하고, 출구 구멍의 팁을 관찰하여 마이크로플루이딕 채널의 충전 상태를 모니터링합니다(그림 2A). 장치를 상온에서 약 5분간 배양하세요.
   메모: BSA는 일반적으로 차단 또는 수동화제로 사용되며, PDMS 폴리머의 소수성 표면에 결합하여 친수성을 높이고 다른 단백질이나 세포(세포 표면 분자를 통해)의 결합을 감소시킵니다.
3. 얇은 젤 로딩 팁을 사용해 각 채널에 재현착된 셀(섹션 4에서)을 적재하며, 출구 채널의 팁을 이용해 셀이 장치 내에서 진행 상황을 모니터링합니다(그림 2B).
   메모: 로딩은 P200 마이크로피펫을 최대 200 μL 부피로 설정한 후, 공기 쿠션을 흡입한 후 피펫 팁 얇은 부피의 약 절반 정도의 작은 부피를 흡입함으로써 용이하게 진행됩니다. 재현탁된 셀의 부피는 정확할 필요는 없으며, PDMS 장치의 부피는 마이크로피펫에 비해 작기 때문입니다. 재현탁된 세포의 밀도에 대한 상한선은 알려져 있지 않으며, 세포 현탁액이 장치에 피펫으로 삽입될 수 있는 한입니다. 세포 덩어리는 장치를 막을 수 있으니 철저한 피펫팅 및/또는 와류 혼합을 통해 피해야 합니다.
4. 젤 로딩 팁을 출구 구멍에서 하나씩 부드럽게 제거하여 기기 손상을 방지하세요.
5. 적절한 로터 어댑터에 장착된 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 약 6,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다(그림 2C).
   메모: 마이크로 원심분리기 로터에 맞게 설계된 맞춤형 가공 알루미늄 로터 어댑터가 사용되었습니다(그림 2C). 적절한 로터 어댑터와 함께 다양한 원심분리기 모델이 사용될 수 있습니다. 어댑터의 중요한 특징은 셀 트렌치의 닫힌 끝 방향으로 측면 힘을 제공하여 셀을 측면 채널로 밀어넣는다는 점입니다.
6. 현미경(그림 3)에서 성공적으로 적재를 확인하되, 장치를 슬라이드 홀더/스테이지 인서트에 부착하지 않습니다.
   메모: 이 프로토콜에서는 60X, 1.4 NA Ph3 오일 침지 대물렌즈를 이 단계에서 검증과 이후 영상 촬영에 사용합니다.

6. 장치 조립, 평형 및 장착

1. PDMS 양쪽의 커버 유리를 스테이지 인서트 하단에 테이프로 고정하여 부재된 장치를 스테이지 인서트에 조심스럽게 장착하세요(즉, 장치를 부착하기 전에 스테이지 인서트를 뒤집어 놓으세요). 단계 삽입 장치 어셈블리를 뒤집어 PDMS가 위를 향하게 한 뒤, 먼지 없는 닦기(그림 2D)와 같은 부드러운 표면에 올려놓으세요.
2. 1상 주사기 펌프의 유량을 35 μL/min으로 조정하세요. 한 번에 한 통로씩 작업하며, 입구 바늘을 삽입한 다음 배출 바늘(즉, 폐기물 비커로 연결되는 것)을 넣습니다. 그림 2E).
3. 먼지 없는 깨끗한 물티슈로 과도한 매질을 닦아내고, 기기 내 누수 여부를 육안으로 점검하세요. 배출구 튜브에 과잉 세포(일반적으로 탁한 줄무늬로 나타나는 형태)와 중간 반월판이 점차 폐기물 비커 쪽으로 이동하는지 살펴보세요.
4. 장치를 약 15-30분 동안 35 μL/min으로 작동시키고, 연결된 모든 레인이 폐기물 비커로 배수될 때까지 허용합니다.
5. 1상 주사기 펌프를 1.5 μL/min으로 설정하고 흐름을 일시정지하세요. 전체 펌프와 장치 장치를 현미경으로 가져가세요(이 과정은 모두 롤링 카트에 올려놓으면 도움이 됩니다) 그리고 1상 배지 흐름을 1.5 μL/min으로 재시작합니다. 장치가 포함된 스테이지 인서트를 반전 형광 현미경에 조심스럽게 장착하며, 필요에 따라 테이프를 사용해 입구 및 출구 튜빙을 라우팅합니다.
6. 영상 촬영을 위해 기기에서 원하는 위치를 찾아 원하는 영상 촬영을 시작하세요. 세포는 일반적으로 정상 상태 지수 단계 성장에 도달하는 데 몇 시간(약 10세대)이 걸리며, 이미지 획득 시작은 원하는 대로 지연되어 평형 기간 이후에 영상이 시작될 수 있습니다.
   메모: 지수적 상에 머무는 세포의 정상 성장은 세포 분열 시간을 추적하고 일정한 최소값에 도달했는지 확인하여 후속 영상 분석 시 확인해야 합니다.

결과

그림 1: 마이크로플루이딕 장치의 회로도. 장치 회로도는 대략적인 축척에 맞게 표시되어 있습니다. 알파벳 지정자는 둔한 끝 바늘을 연결하기 위해 구멍을 낸 입구 및 출구 구역과 함께 표시되어 있습니다. 일반적으로 패턴 채널의 절반(음영 회색)이 사용됩니다. 셀 트렌치는 지정자를 향해 배치되어 있습니다.

재료