마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 운동성 평가

Abstract

출처: Scheidweiler, D. 외. 유체 장치와 현미경 및 유동 세포분석을 결합하여 공간적 규모를 넘어 다공성 배지 내 미생물 수송을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2020).

이 영상은 무작위로 배열된 기둥들로 구성된 다공성 매트릭스를 통해 박테리아의 운동성을 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 형광 표지된 박테리아를 장치에 투입하고, 다공성 매트릭스를 통과해 관찰 채널로 이동하는 동안 현미경으로 영상화한 후 분석하여 돌파 곡선(BTC)을 생성합니다.

Protocol

1. 박테리아 배양 조건

1. 층류 후드 하에서, 녹색 형광 단백질(GFP) 표지된 Pseudomonas putida KT2440 글리세롤 스톡 100 μL (1 ×^{10 7 mL-1}, -80 °C에 보관)을 사용하여 5mL의 루리아-베르타니(LB) 배지를 접종합니다. 30°C에서 250rpm으로 진동시키며 하룻밤 배양하세요.
2. 다음 날, 100 μL 배양액을 5 mL LB 배지에 재현탁하고 같은 조건에서 5시간(지수적 위상) 배양합니다. 1 mL 알리코트를 2 mL 튜브에 샘플링하고, 실온(~15분)까지 식힌 후 원심분리기(2300 x g 5분)에 넣습니다.
3. 상원액을 제거하고 1mL의 운동성 완충제를 펠릿에 추가하세요. 샘플을 균질화하기 위해 잠시 소용돌이를 사용했습니다. 원하는 세포 농도에 도달할 때까지 희석하라, 예를 들어 5 x 10^{5 mL-1}.
4. 하천에서 유래한 자연 군집 실험의 경우, 비선택적 재배지를 준비합니다. 예를 들어, 멸균 여과 및 오토클레이드 처리된 하천수나 복합 탄소원(LB 매체)으로 개량된 인공 하천 수질 매체를 사용하세요.

2. 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로플루이딕 장치 준비

1. 반경 크기와 중심 좌표로 설명된 원(즉, 불투수성 장애물)으로 구성된 컴퓨터 지원 제도(CAD) 소프트웨어를 통해 원하는 다공성 기하학을 설계합니다.
   참고: 무작위 결정립과 기공 크기를 가진 다공성 기하학의 예시는 그림 1A에 제공되어 있습니다. 출구 근처에 장애물이 없는 관측 채널은 돌파 곡선(BTC)의 획득을 용이하게 합니다.
2. 선택한 기하학을 바탕으로 표준 SU-8 포토리소그래피를 사용해 몰드를 준비합니다.
   참고: 또는 전용 마이크로패브리케이션 시설에서 몰드를 주문할 수도 있습니다. 수평면에서 이질적인 유체 흐름을 얻기 위해서는 평균 기공 목구멍 크기와 동일한 규모의 마이크로유체 챔버 두께를 설계하는 것이 중요합니다. 하지만 마이크로플루이딕 장치의 크기가 현미경 관찰(예: 현미경 슬라이드 작업)에 적합한지 반드시 확인해야 합니다.
3. 주사기를 사용하지 않고 주사기를 사용해 무게 기준으로 10%의 가교자(디메틸, 메틸수소 실록산 공중합체)를 엘라스토머에 첨가하여 50g PDMS를 준비합니다. 깨끗한 환경에서 작업하고 가능한 한 먼지를 피하세요. 두 시약을 깨끗한 일회용 용기에 섞어 100 mbar의 진공을 30분간 적용하여 점성 PDMS에서 용해된 공기와 기포를 제거합니다.
4. 몰드를 페트리 접시(직경 100mm, 높이 15mm)에 넣으세요. PDMS를 원하는 높이(예: 2-5mm)로 몰드에 부어줍니다. 페트리 접시를 덮고 60°C에서 4시간 동안 보관하세요(두꺼운 층은 하룻밤 보관)을 통해 경화시키세요.
   참고: 시각화 목적을 위해 빛이 PDMS를 통과할 수 있어야 합니다; 따라서 2mm에서 5mm 사이의 얇은 층이 바람직합니다. 두꺼운 층(>5mm)은 장치의 투명도를 감소시키고, 얇은 층은 적용 중 변형을 겪습니다.
5. 곰팡이를 오븐에서 꺼내고 마이크로플루이딕 장치를 실온까지 식히세요. 식으면 메스로 원하는 PDMS 부분을 조심스럽게 제거하세요.
   참고: 몰드에 강한 압력이 가해지면 몰드 균열이 발생합니다. PDMS를 맨손으로 만지지 마세요. 지문이 광학 투명도에 영향을 줄 수 있습니다.
6. PDMS 채널 하단(원하는 기하학이 새겨진 부분)을 테이프로 임시로 밀봉하세요. 0.5mm 직경의 생검 펀처를 사용해 마이크로유체 채널을 뚫어 0.5mm(내경) 튜빙을 맞는 입구와 출구를 만듭니다.
   참고: PDMS의 부드러운 특성 덕분에 튜브를 삽입할 때 조임이 보장됩니다. PDMS가 유리에 밀봉된 후에는 입구 및 출구 채널을 만들 수 없습니다.
7. 고주파 발생기(플라즈마 본더, 재료표)를 이용해 산소-플라즈마 결합을 통해 마이크로유체 채널을 밀봉합니다. 이를 위해 규산염 유리 슬라이드(25mm x 75mm)를 에탄올로 청소하고 건조시키세요. PDMS 채널에서 테이프를 제거하고, 다공성 면이 위를 향하게 한 채널을 설치하세요. 실리케이트 유리 슬라이드와 PDMS 표면을 실온에서 약 45초간 플라즈마로 처리하세요.
8. PDMS 채널을 규산염 유리 슬라이드에 올려놓고 핫플레이트 위에서 100°C에서 30분간 가열합니다.
9. 핫플레이트에서 마이크로플루이딕 장치를 제거하고 실온으로 냉각하세요. PDMS 채널 인렛을 튜빙으로 연결하세요. PDMS는 거의 유체에 불투과하지만 가스에는 투과성이 있는 PDMS에서 공기를 제거하기 위해 30분간 진공을 적용하세요.
10. 운동성 완충제 100 mL(10 mM 인산칼륨, 0.1 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA), 1% w/v 포도당, pH 7.0 보충제)를 준비하고, 10 μL ^min-1 용량으로 작동하는 주사기 펌프를 사용해 마이크로플루이딕 장치에 1mL를 주입합니다.
    참고: PDMS가 이전 진공 단계로 인해 가스 포화 상태가 낮아 기포는 ~30분 이내에 사라집니다.

3. PDMS 마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 수송 분석

1. PDMS 마이크로유체 장치를 현미경 스테이지에 미리 포화 상태로 배치합니다. 스테이지 이동 중 흐름 방해를 최소화하기 위해 테이프를 사용해 튜브를 고정하세요.
2. 현미경 스테이지를 출구 근처의 관측 채널로 옮기세요. 밝은 필드 현미경 또는 위상 대비를 사용하여 관측 채널의 중심에 초점을 맞추고 배율을 조절하여 개별 박테리아 세포를 시각화합니다.
3. 빛 경로 설정을 형광 현미경으로 전환하고, 카메라 노출 시간을 조정하여 개별 박테리아 세포를 분해하거나 세포의 형광 신호가 배경 잡음보다 최소 3배 강하도록 조정하세요.
4. 다음으로, 입구 튜브를 박테리아 현탁액이 들어 있는 2mL 튜브에 삽입합니다. 펌프 방향을 반대로 돌리고 1 μL min-1의 유량으로 현탁을 빼내기 시작합니다.
5. 전체 관측 채널의 단면을 스캔하여 실험 기간 동안 2분마다 합성 영상을 기록합니다.

Results

그림 1: 다공성 매질 내 미생물 수송을 연구하는 유체 장치 (A) 폴리(메틸 메타크릴레이트, PMMA)로 밀링된 유체 장치 그림. 다공성 매트릭스는 장치의 기저층에 밀링되고, 뚜껑은 나사로 닫힙니다. 단면도는 유체 장치 내 기둥들의 배열을 보여줍니다. 인서트는 규칙적으로 배치된 기둥 격자와 해당 속도 흐름장을 가진 다공성 매트릭스를 보여줍니다. (B) 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치는 현미경 유리 슬라이드에 장착되어 있습니다...

Materials