박테리아 효과 단백질을 발현하는 세포로의 유도성 유전자 발현 시스템과의 형질전환

초록

출처: Berens, C. 외. 유도성 발현 시스템을 적용하여 박테리아 병원성 인자가 세포 내 신호 전달에 미치는 간섭을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2015)

이 영상은 박테리아 효과 단백질 CaeB가 숙주 세포자사멸 연쇄 반응을 방해하는 위치를 식별하기 위해 유도 발현 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 CaeB 발현 세포를 테트라사이클린 반응 시스템으로 형질전환하여 프로세포자사멸 유전자 발현을 유도하는 과정을 개괄하며, 이를 통해 연쇄 반응 내 교란 지점을 식별합니다.

프로토콜

1. 유도 발현 벡터 시스템으로 안정 세포주를 형질전환

1. 12웰 플레이트에서 1 x 10⁵ 세포 밀도의 인간 배아 신장(HEK)293 세포가 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 GFP-CaeB를 안정적으로 발현합니다.
2. 시드 후 19시간 후, 배스 또는 활성화된 카스파제3를 암호화하는 조절자 플라스미드 및 반응 플라스미드와 세포를 공동 트랜스펙션합니다.
   1. 안정된 HEK293 세포를 100ng의 pWHE125-P 조절자 플라스미드(그림 1)와 반응 플라스미드 pWHE655-hBax 또는 pWHE655-revCasp3(그림 2), 그리고 0.4μl의 폴리에틸레니민과 함께 공동 트랜스펙팅합니다.
   2. 디옥시리보핵산(DNA)과 폴리에틸레니민 트랜스펙션 시약을 각각 75 μl Opti-MEM 배지에 준비하고 상온(RT)에서 정확히 5분간 배양합니다. 복합체 형성을 위해서는 두 혼합물을 RT에서 15분간 함께 배양하세요.
3. 폴리에틸레니민/DNA 용액을 세포에 점적으로 첨가하고 37°C에서 5%_CO2에 배양합니다.

2. 세포자멸증 유도

1. 형질전환 후 5시간 후, 배양지에 1 μg/ml의 독시사이클린을 첨가하여 세포자사자 차단 단백질의 발현을 유도합니다. 세포를 37°C에서 5%_CO2에서 18시간 배양합니다.

결과

그림 1. 조절 플라스미드 pWHE125의 개략 개요. 박테리아 내 전파에 필수적인 요소들로, 복제 기원(ori pBR)과 암피실린에 대한 항생제 내성 카세트(Amp^R), 그리고 테트 전이조절제의 발현에 필수적인 요소들로는 인간 거대세포바이러스의 강력하고 구성적인 즉각적 초기 촉진자/증강제(P/E_hCMV), 소아마비바이러스의 내부 리보솜 결합 부위(PV-IRES), ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	생명체 기술	31966-021
FCS	바이오크롬	S0115
펜/연쇄상구균	생명체 기술	15140-122
옵티멤	생명체 기술	51985
엑트릭진 9	로슈	6365752001
폴리에틸레니민	폴리시엔네스	23966
독시사이클린	시그마 올드리치	D9891