유전자 변형 박테리아 세포에서 표적 효소 발현 검출

초록

출처: Kim, H. 외, 고처리량 유전효소 스크리닝 시스템을 이용한 다효소 스크리닝. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 메타게놈 포스미드 라이브러리와 염색 기질을 이용한 효소 발현을 검출하는 유전적 스크리닝 방법을 시연합니다. 유세포분석은 색소 생성물을 생성하는 단일 세포를 식별하고 분리하여 활성 효소 발현 세포의 고처리량 선택을 가능하게 합니다.

프로토콜

1. p-니트로페놀(pNP) 검출을 위한 유전 효소 스크리닝 시스템으로 메타게놈 라이브러리 준비 (pNP-GESS)
   1. 포스미드 라이브러리 생산 키트를 사용하여 포스미드 벡터를 사용하여 대장균에 메타게놈 라이브러리를 구축합니다.
   2. 라이브러리 100 μl을 −70 °C에서 저장하기 위해 분리 보관하는데, 이는 메타게놈 라이브러리 세포의 원천입니다.
      메모: 이 라이브러리 재고의 600 nm 파장(OD₆₀₀)에서 측정된 시료의 광학 밀도는 약 100입니다.
   3. 스톡 메타게놈 라이브러리 100 μl을 얼음 위에 해동하고, 500 ml 플라스크에 접종한 후 500 ml 플라스크에 접종합니다. 이 플라스크에는 500 ml 루리아-베르타니(LB)와 12.5 μg/ml 클로람페니콜이 들어 있으며, 37 °C 환경에서 2시간 배양합니다.
   4. 세포를 50ml 원뿔형 튜브에서 1,000 x g에서 4 °C에서 20분간 원심분리하여 채취합니다.
   5. 펠릿을 50ml 얼음 증류수(DW)에 빠르게 재현탁한 후, 1,000 x g에서 원심분리기에서 4°C에서 20분간 보관합니다.
   6. 펠릿을 10% (v/v) 글리세롤과 함께 50μl 얼음 냉각 DW에 재현탁합니다. 이 셀 알리코트 50 μl을 전기천공에 사용하세요.
   7. 전기적합성 세포 50 μl과 pGESS(E135K) DNA(100ng) 혼합물을 얼음 전기천공 쿠벳에 넣고 혼합물을 전기공공(1.8 kV/cm, 25 μF)으로 투여합니다.
   8. 카타볼라이트 억제(SOC) 배지와 함께 1ml의 초최적 육수를 빠르게 추가하고 세포를 부드럽게 재현탁합니다.
   9. 피펫을 사용해 세포를 14ml 둥근 바닥 튜브에 옮기고 37°C에서 1시간 배양합니다.
   10. 회수한 세포 500 μl을 12.5 μg/ml 클로람페니콜과 50 μg/ml 암피실린이 포함된 LB 크기의 20 x 20 cm 정사각형 플레이트에 발랐습니다. 플레이트를 30°C에서 12시간 배양하세요.
   11. 세포 스크레이퍼로 군락을 긁어내고, 얼음처럼 차가운 세포 저장 매체를 사용해 50ml 원뿔형 튜브에 세포를 모으세요.
   12. 1,000 x g 원심분리기를 4 °C에서 20분간 보관합니다. 펠릿을 10ml 얼음 냉각 저장 배지에 재현탁하여 OD₆₀₀ /100에 도달합니다.
   13. −70 °C에서 저장할 수 있도록 셀 20μl을 할당합니다.
        
2. 메타게놈 라이브러리에서 거짓 양성 제거
   1. 1.13단계의 기본 메타게놈 라이브러리 세포(메타게놈 DNA 포스미드와 pGESS(E135K)를 얼음 위에 해동합니다.
   2. 세포 10 μl을 2 ml LB에 50 μg/ml 암피실린과 12.5 μg/ml 클로람페니콜을 14ml 둥근 바닥 튜브에 접종합니다. 37°C에서 200rpm에서 흔들며 4시간 동안 부양하세요.
   3. 그동안 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 기계를 켜고 기본 FACS 소프트웨어를 열어보세요. 다음 설정을 사용하세요: 노즐 팁 직경 70 μm; 전방 산란 면적(FSC-A) 감도, 300 V-로그 증폭; 측면 산란 면적(SSC-A) 감도, 350 V-로그 증폭; 플루오레세인 이소티오시아네이트 면적(FITC-A) 감도, 450 V-로그 증폭; 임계값 매개변수, FSC-A 값 5.
      메모: 재료표에 언급 된 FACS 장치에 대한 일반적인 설정이 제시되어 있습니다. 다른 FACS 기기들의 설정을 조정하세요.
   4. 2.2단계의 메타게놈 라이브러리 세포를 5 μl을 5ml 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 둥근 바닥 튜브에 첨가하여 희석합니다.
   5. 희석된 라이브러리 샘플을 FACS 기기의 로딩 포트에 놓고 FACS 소프트웨어의 획득 대시보드에서 로드 버튼을 클릭합니다.
   6. 대시보드의 플로우 레이트 버튼을 클릭하고 제어하여 이벤트 속도를 1,000 - 1,500 이벤트/초로 조정하세요.
   7. 툴바의 Dot Plot 버튼을 클릭하여 로그 로그 축척 FSC-A vs. 로그 척도 SSC-A 산점도를 글로벌 워크시트에서 생성하세요. 툴바의 폴리곤 게이트 버튼을 사용해 산란 게이트 R1을 싱글렛 이벤트(박테리아 개체군)를 포함하도록 조정하세요.
   8. 히스토그램 버튼을 클릭하여 워크시트에 셀 수 와 로그 척도의 FITC-A를 비교해 히스토그램을 작성하세요. 그 다음 검사관 제어 창의 세포계 설정 탭에서 FITC 전압을 조정하여 종형 분포의 피크가 FITC-A의 10² 미만이 되도록 합니다.
   9. 로그 스케일의 FSC-A를 생성하는 것과 글로벌 워크시트의 도트 플롯 버튼을 클릭하여 로그 FITC-A 플롯을 작성할 수 있습니다. 툴바의 폴리곤 게이트 버튼을 이용해 플롯에 정렬 게이트 R2를 설정하여, 게이트가 분포 중심에서 +5%에서 -5% 사이(종 모양 곡선 꼭대기 주변 10% 셀 사이)에 위치하도록 합니다.
   10. FACS 기기 출구에 50 μg/ml의 암피실린과 12.5 μg/ml의 클로람페니콜이 포함된 1.2 ml LB를 채취관으로 놓고, R1 및 R2 게이트 모두를 만족하는⁶ 세포 10개를 분리합니다.
   11. 수집관과 캡을 제거한 후 부드럽게 소용돌이를 돌리세요.
        
3. 메타게놈 효소 스크리닝
   1. 2.11단계부터 분류된 세포를 37 °C에서 200 rpm에서 진동시키고 OD₆₀₀ 이 0.5에 도달할 때까지 배양합니다.
   2. 세포 내 포스미드 복사 수를 증폭시키기 위해 1 μl 복사 유도액을 추가합니다. 세포를 37°C에서 추가로 3시간 배양하고, 250rpm에서 흔듭니다.
   3. 세포 분류 준비를 위해 배양된 세포 0.5ml와 적절한 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-셀로바이오사이드, 또는 페닐 인산염)을 14ml 둥근 바닥 튜브에 최종 농도 100 μM로 첨가합니다.
      1. 대조군 샘플의 경우, 3.2단계에서 배양한 세포 0.5ml를 14ml 둥근 바닥 튜브에 넣으세요. 3.3단계에서 기질 부피와 같은 부피의 PBS를 추가하세요.
   4. 두 샘플을 37°C에서 200rpm에서 흔들며 3시간 동안 배양합니다.
   5. 그동안 FACS 기계는 2.3단계와 동일한 구성으로 준비하세요.
   6. 세포 5μl(분류용)과 대조군 세포를 각각 1ml PBS가 들어 있는 5ml 둥근 바닥 튜브 두 개에 추가합니다.
   7. 제어 셀이 포함된 튜브를 FACS의 로딩 포트에 놓고 FACS 소프트웨어의 획득 대시보드에서 로드 버튼을 클릭합니다. 대시보드의 플로우 레이트 버튼을 제어하여 이벤트 속도를 1,000 - 3,000 이벤트/초로 조정하세요.
   8. 소프트웨어의 글로벌 워크시트에서 Dot Plot 버튼을 클릭하여 로그 로그 척도의 FSC-A 와 로그 척도의 SSC-A 산란도를 생성하고, 툴바의 폴리곤 게이트 버튼을 이용해 산란 게이트 R1을 싱글렛 이벤트(박테리아 개체군)를 포함하도록 조정하세요.
   9. 워크시트의 도트 플롯 버튼을 클릭하여 로그 로그 축척 FSC-A vs. 로그 축척 FITC-A 산점도를 생성하고, 툴바의 폴리곤 게이트 버튼을 사용해 R2 게이트 내에서 0.1% 미만의 음수 셀이 감지되도록 정렬 게이트 R2를 설정하세요.
   10. 제어 샘플 튜브를 분류 샘플 튜브로 교체하고, 대시보드의 플로우 레이트 버튼을 조작하여 이벤트 속도를 1,000 - 3,000 이벤트/초로 조정하세요.
   11. FACS 기기 출구에 0.5ml LB가 담긴 수집관을 설치하고, R1과 R2 게이트 모두를 만족하는⁴ 셀 10개를 분리합니다.
       메모: 정렬 기준은 R2 게이트에서 FITC-A의 상위 0.1%에서 5%까지 다양합니다. 이 프로토콜에서는 상위 1%의 세포가 양성으로 수집되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
복사 제어	진원지	CCFOS110	포스미드 라이브러리 생산 키트
CopyControl 유도 솔루션	진원지	CCIS125	포스미드 복사 유도 솔루션
EPI300	진원지	EC300110	전기적성 전지
pCC1FOS	진원지	CCFOS110	포스미드 벡터
유전자 펄서 Mxcell	바이오-래드		전기천공 쿠벳 및 전기공공 시스템
FACSAria III	벡턴 디킨슨		유동 세포 측정 (FACS 기계)
AZ100M	니콘		현미경
울트라슬림	마에스트로겐		LED 일광기
50ml 원뿔관	BD 팔콘
14ml 둥근 바닥 튜브	BD 팔콘
5ml 둥근 바닥 튜브	BD 팔콘
p-니트로페닐 인산염	시그마-올드리치	N7653	기판
p-니트로페닐 β-D-셀로바이오사이드	시그마-올드리치	N5759	기판
p-니트로페닐 부틸레이트	시그마-올드리치	N9876	기판
루리아-베르타니 (라인배커)	BD 디프코	244620	트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L
초최적 육수 (SOB)	BD 디프코	244310	트립톤 20 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 황산마그네슘 2.4 g/L, 염화칼륨 186 mg/L
이산화물 억제(SOC)를 포함한 최적 육수		SOB, 0.4% 포도당
효모 추출물 트립톤 2개 (2개 YT)	BD 디프코	244020	췌장 소화액 카제인 16 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L
셀 저장 매체			유튜브 육수 2개, 글리세롤 15%, 포도당 2%
pGESS(E135K)			dmpR, egfp 유전자와 그 적절한 프로모터, RBS, 그리고 종결자를 포함하는 DNA 벡터입니다. 자세한 내용은 원고의 참고문헌 5를 참조하세요.
클로람페니콜	시그마	C0378
암피실린	시그마	A9518
BD FACSDiva	벡턴 디킨슨		플로우 사이토메트리 소프트웨어 버전 7.0
PBS	깁코	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% 인산나트륨, 0.024% 인산칼륨, pH 7.4