출처: 아흐마디, S. 외. 인체 대변 미생물군에 대한 중재적 요법의 효과를 추정하기 위한 시험관 내 배치 배양 모델. J. Vis. 경험 (2019).
이 영상은 식이 발효성 섬유를 배양하여 장내 미생물 미생물의 대사물 생성을 연구하기 위해 장내 미생물 발효를 모델링하는 방법을 시연합니다.
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방법 논문
시험관 내 인간 장내 미생물군에 의한 대장 발효를 모방하는 배치 배양 모델
786 조회수
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2025년 11월 28일
이 논문에서
초록
프로토콜
샘플 채취와 관련된 모든 절차는 기관의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
주의: 적절한 물질안전보건자료(SMD)를 참고하여 적절한 생물안전 레벨 2(BSL-2) 교육을 위한 지침과 지침을 따르십시오. 표준 생물안전 규정에 따라 모든 배양 단계를 따르고, 무균 조건에서 BSL-2 캐비닛을 사용하세요. 더불어, 다양한 모델과 인간 대상 대변 샘플은 미생물 매개 질병 확산 위험을 가질 수 있습니다. 부상이나 감염이 발생하면 즉시 의료 지원을 받으세요. 또한, 인간 및 동물 대변 샘플 사용은 기관 윤리 위원회의 승인을 받아야 하며, 샘플 및 피험자 정보 사용 프로토콜을 준수해야 합니다.
1. 배양 매체 준비
- 배양 배지 준비, 9가지 종류의 스톡 용액을 준비하세요:
- 용액 A (1,000 mL): 염화나트륨 5.4g(NaCl), 인산칼륨 2.7g(KH2PO4), 염화칼슘 0.16 g(CaCl2·2H2O), 6수화물 마그네슘 0.12 g(MgCl2·6H2O), 0.06g 염화 망간 사수화물(MnCl2·4H2O) 용해, 0.06g의 코발토스 클로라이드 육수화물(CoCl2·6H2O)과 5.4g 황산암모늄(NH4)2SO4를 탈이온수에 넣어 총 부피를 1,000 mL로 만들었습니다.
- 용액 B (1,000 mL): 2.7g 인산칼륨(K2HPO4)을 탈이온수에 녹여 총 부피를 1000 mL로 만듭니다.
- 미량 광물 용액(1,000 mL): 이나트륨 에틸렌디아민-테트라아세테이트 이수화물 500 mg(Na2EDTA), 200 mg 황산철 헵타하이드레이트(FeSO 4.7H2O), 황산 아연 헵타하이드레이트 10 mg(ZnSO4.7H 2O), 망간(II) 염화물 사수화물 3 mg(MnCl2·4H2O), 인산 30 mg(H3PO4) 용해, 탈이온수에 CoCl2.6H 2O, 1 mg의 염화큐리산 이하이드레이트(CuCl2·2H2O), 2 mg의 니켈(II) 염화물 육수화물(NiCl 2.6H2O), 3 mg의 몰리브데이트 이하이드레이트(Na2MoO4·2H2O)를 탈이온수에 넣어 총 부피를 1,000 mL로 만듭니다.
메모: 이 용액은 빛에 민감하므로, 반드시 어두운 검은색 또는 알루미늄 포장된 튜브/병에 보관하세요. - 수용성 비타민 용액(1,000 mL): 탈이온수에 티아민 염산(티아민-HCl) 100mg, D-판토텐산 100mg, 나이아신 100mg, 피리독신 100mg, P-아미노벤조산 5mg, 비타민 B12 0.25mg을 탈이온수에 녹여 총 부피를 1,000 mL로 만듭니다.
- 엽산: 비오틴 용액(1,000 mL): 엽산 10mg, D-비오틴 2mg, 탄산암모늄 중탄산염 100mg(NH4HCO3)을 탈이온수에 녹여 총 부피를 1,000 mL로 만듭니다.
- 리보플라빈 용액(1,000 mL): 10 mg의 리보플라빈을 5 mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산, 1.19 g/L) 용액에 녹여 총 부피를 1,000 mL로 만듭니다.
- 헤민 용액(10 mL): 5,000 mg의 헤민을 10 mM 수산화나트륨(NaOH)(0.4 g/L) 용액에 녹여 총 부피를 10 mL로 만듭니다.
- 단쇄 지방산 혼합물(10 mL): N-발레레이트 2.5 mL, 이소발레이트 2.5 mL, 이소부티레이트 2.5 mL, DL-α-메틸부티레이트 2.5 mL를 혼합합니다.
메모: 이 방법은 냄새와 연기를 피하기 위해 후드 내에 사용하는 것이 권장됩니다. - 레사주린 (1,000 mL): 1g의 레사주린을 탈이온수에 녹여 전체 부피를 1,000 mL로 만듭니다.
- 시험관 내 혐기성 발효에 사용되는 배지
- 이 배지를 준비하기 위해 용액 A 330 mL, 용액 B 330 mL, 미량 미네랄 용액 10 mL, 수용성 수용성 비타민 용액 20 mL, 엽산 5 mL(비오틴 용액), 리보플라빈 용액 5 mL를 혼합합니다; 헤민 용액 2.5 mL, 단쇄 지방산 혼합물 0.4 mL, 레사주린 1 mL, 효모 추출물 0.5 g, 탄산나트륨 4 g(Na2CO3), 시스테인 HCl-H2O 0.5 g, 트립티카제 0.5 g, 증류수 296.1 mL를 추가합니다.
- pH를 확인하고 약 7.0 정도인지 확인하세요; 만약 아니라면, 1N HCl 또는 1N NaOH로 pH를 조절하세요. 멸균 작업대 아래 병 필터를 사용해 배지를 진공 여과하여 멸균하세요.
- 또는 비타민과 헤민 용액 제외의 모든 성분을 섞어 121°C에서 오토클레이브를 20분간 보관한 후 실온까지 식히세요. 동시에 0.22 μm 멤브레인 필터를 사용해 비타민 및 헤민 용액을 여과-멸균하여 오토클레이브하고 냉각한 매체에 첨가한 후 분배합니다.
2. 혐기성 챔버 및 필요한 재료 준비
- 발효 실험에 필요한 모든 재료, 용액, 도구를 실험 시작 최소 48시간 전에 혐기성 챔버 내에 보관하여, 도구와 완충제/용액 내 용해성 산소와 관련된 잔류 산소가 제거되고 모든 물질이 설정된 혐기성 조건에 적응하도록 해야 합니다.
메모: 혐기성 챔버 내부에 필요한 재료(실험 시작 48시간 전): (i) 발효 배지; (ii) 혐기성 용액(4.1절에 따라 준비), (iii) 와류, (iv) 저울, (v) 무슬린 치즈 천, (vi) 가위, (vii) 깔때기, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 mL 튜브, (ix) 피펫터(2, 20, 200, 1,000 μL) 및 호환 피펫 팁, (x) 건 피펫 및 피펫(5 및 10 mL), (xi) 종이 휴지, (xii) 마커, (xiii) 서로 다른 튜브를 위한 튜브, (xiv) 쓰레기통, (xv) 산소 표시기, (xvi) 70% 에탄올 분무기(소독제).
3. 튜브 및 섬유 준비
- 300mg의 이눌린을 무게로 무게를 내어 50mL 튜브로 옮긴 후, 이미 준비되어 혐기성 챔버에 보관된 26mL의 발효 매체를 무균으로 첨가합니다. 각 대변 샘플 유형과 실험용 튜브(검사 대상 화합물 수에 따라 3배)에 대해 빈 튜브 1개를 준비하세요.
- 발효 실험을 시작하기 전에 샘플의 수분을 공급하기 위해 이 튜브들을 혐산소 챔버 안에 약 24시간 두세요. 접종 시 튜브 온도가 37°C로 유지되도록 하므로, 튜브를 혐기성 챔버 안에 넣은 인큐베이터에 보관하세요.
4. 접종 준비
- 혐기성 희석 용액(발효 실험 최소 48시간 전): NaCl 5g, 포도당 2g, 시스테인-HCl 0.3g을 탈이온수에 녹여 총 부피를 1,000mL로 만든다. 오토클레이브하여 사용 최소 48시간 전에 혐기성 챔버에 보관하세요.
- 대변 접종 준비 (발효 실험 당일): 50 mL 원뿔 튜브에 신선한 대변 샘플 5g을 무게 내고, 혐기성 희석 용액을 50 mL(1:10 w/v)로 최종 부피로 넣은 후 15분 또는 완전히 균질될 때까지 소용돌이를 사용합니다. 균질화된 혼합물을 멸균된 치즈클로스(오토클레이드 처리)로 4겹 걸러내고, 즉시 배지가 포함된 튜브에 접종을 위해 사용하세요.
메모: 특정 화합물/성분이 전반적인 건강한 분변 미생물군과 병든 분변 미생물군에 미치는 영향을 비교하는 실험 목적이라면, 피험자 그룹의 대변 샘플을 합산할 수 있습니다.
5. 발효 및 샘플링
- 4.2절에 따라 튜브를 준비하고, 빈 튜브/대조관 및 실험용 튜브에 희석 및 여과된 대변 접종액 4mL를 접종합니다. 접종관을 혐기성 챔버 내에서 37°C에서 배양하세요. 섬유와 접종체를 다시 현지시키기 위해 튜브를 부드럽게 뒤집어 한 시간마다 흔들어 주세요.
- 예를 들어, 발효 중 0시간, 3시간, 6시간, 9시간, 24시간마다 샘플을 각각 발효 튜브에서 2mL 튜브로 꺼내 샘플을 2시간마다 채취하여 필요에 따라 샘플을 수집합니다.
- 실험실 pH 미터기를 사용해 알리코트의 pH를 측정하라(pH 전극을 시료에 직접 삽입함); 남은 샘플을 14,000 x g 온도에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 즉시 상정액과 펠릿을 액체 질소에 냉동한 후 급동 후 SCFA(단쇄 지방산) 분석용으로, 미생물군 분석용 펠릿을 -80 °C에 보관합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 탄산암모늄 | 시그마-올드리치 | 217255 | |
| 황산암모늄 | TGI | C2388 | 유독 |
| 염화칼슘 이하이드레이트 | 시그마-올드리치 | C3306 | 자극 |
| 코발투스 클로라이드 육수화물 | 시그마-올드리치 | 255599 | |
| 클로라이드 이하이드레이트 큐립 | 아크로스 오가닉스 | 2063450000 | 독성이 강하고 짜증나게 |
| 시스테인-HCl | 시그마-올드리치 | C121800 | |
| D-비오틴 | 시그마-올드리치 | B4501 | |
| D-판토텐산 | 알파 에이사르 | A16609 | |
| 디나트륨 에틸렌디아미네테트라아세테이트 이하이드레이트 | 바이오라드 | 1610729 | |
| DL-α-메틸부티레이트 | 시그마-올드리치 | W271918 | |
| 황산철 일수화물 | 시그마-올드리치 | F8263 | 유독 |
| 엽산 | 알파 에이사르 | J62937 | |
| 포도당 | 시그마-올드리치 | G8270 | |
| 헤민 | 시그마-올드리치 | H9039 | |
| 헤페스 | 알파 에이사르 | A14777 | |
| 아이소부티레이트 | 알파 에이사르 | L04038 | |
| 이소발레 | 알파 에이사르 | A18642 | |
| 육수화마그네슘 클로라이드 | 시그마-올드리치 | M8266 | |
| 염화망간, 사수화물 | 시그마-올드리치 | 221279 | |
| 나이아신 (니코틴산) | 시그마-올드리치 | N4126 | |
| 니켈(II) 염화물 육수화물 | 알파 에이사르 | A14366 | 유독 |
| N-발레레이트 | 시그마-올드리치 | 240370 | |
| P-아미노벤조산 | 중국 국회의원 | 102569 | 독성이 강하고 짜증나게 |
| 인산 | 시그마-올드리치 | P5811 | |
| 인산칼륨 이수소 | 시그마-올드리치 | P5504 | |
| 인산수소 칼륨 | 시그마-올드리치 | 1551128 | |
| 피리독신 | 알파 에이사르 | A12041 | |
| 레사주린 | 시그마-올드리치 | R7017 | |
| 리보플라빈 | 알파 에이사르 | A11764 | |
| 소다 | 시그마-올드리치 | 1613757 | |
| 소금 | 피셔 바이오리시약 | 7647-14-5 | |
| 수산화나트륨 | 피셔 케미컬스 | S320 | |
| 몰리브데이트 이하이드레이트 나트륨 | 아크로스 오가닉스 | 206375000 | |
| 티아민 염산염 | 아크로스 오가닉스 | 148991000 | |
| 트립티카제 | BD 생명과학 | 211921 | |
| 비타민 B12 | 시그마-올드리치 | V2876 | |
| 효모 추출물 | 시그마-올드리치 | 70161 | |
| 황산아연 헵타하이드레이트 | 시그마-올드리치 | Z0251 | |
| 0.22 μm 막 필터 | |||
| AMPure 자기 정제 비즈 | 아장쿠르 | ||
| 인큐바토레가 있는 혐기성 챔버 | 포마 혐기성 시스템, Thermo Scientific, 미국 | ||
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