Klebsiella pneumoniae에 의한 대나무 가수분해물의 미세 호기성 발효

초록

출처: Wei, D. 외, 대나무 가수분해 원료를 이용한 Klebsiella pneumoniae 의 화학물질 생산. J. Vis. 경험 (2017)

이 영상은 Klebsiella pneumoniae 를 가수분해물 기반 배지에서 미세호기성 및 약한 산성 조건에서 배양하여 대나무 유래 당을 2,3-부탄디올로 미생물적으로 전환하는 과정을 시연합니다.

프로토콜

1. 2,3-부탄디올 생산: Wildtype K. pneumoniae

1. 미디엄 준비용제로 대나무 가수분해물 3L을 사용하세요.
2. 4 g/L 옥수수 스티프 리커, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K₂HPO₄, 3 g/L KH₂PO₄, 0.2 g/L MgSO₄ 발효 배지를 준비합니다. 2.5M NaOH를 사용해 매체의 pH를 중성으로 조절하세요. 발효에는 3L 오토클레이드 발효 매체가 들어 있는 5-L 바이오리액터를 사용하세요.
3. K. pneumoniae 세포를 -80°C 저온 냉장에 보관하세요.
4. 씨앗 배양 시에는 250mL 플라스크에 50mL 루리아-베르타니(LB) 배지를 37°C에서 하룻밤 배양하고, 200rpm에서 흔듭니다. 트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10 g/L 포함된 LB 배지를 사용하세요. 메모: 씨앗 배양의 세포 밀도는 600 nm 광 밀도 OD 2에 도달해야 합니다.
5. 바이오리액터에 50mL 씨앗 배양액이 담긴 플라스크 1개를 접종하세요. 배양 온도는 pH 6.0, 37 °C로 유지하세요. 공기 보충 속도는 분당 2L, 교반 속도는 250 rpm으로 사용하여 미세호기성 상태를 만듭니다.
6. 발효 중 2시간마다 5mL 샘플을 채취하여 고압 액체 크로마토그래피로 분석하여 육수 내 화학 농도를 측정합니다.
7. 미생물 연료전지 시스템/데이터 수집 또는 MFCS/DA를 사용하여 생물반응기에 첨가된 알칼리를 온라인으로 모니터링합니다.
   메모: 발효 과정에서 유기산이 생성되며, 배양 pH를 안정적으로 유지하기 위해 NaOH가 첨가됩니다. 첨가된 알칼리의 양은 산이 생성되는 양을 나타냅니다. 알칼리 첨가 라인이 정체되면 탄소 원이 고갈되거나 세포 사멸로 인해 과정이 종료됩니다.

2. K. pneumoniae의 budC 돌연변이체에 의한 R-아세톤 생산

1. 아세톤 생산용 매체를 준비하는데, 옥수수 스티프 리큐어 4 g/L, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L 아세테이트 나트륨, 0.4 g/L KCl, 0.1 g/L MgSO₄를 포함합니다.
2. R-아세톤 생산에는 K. pneumoniae-ΔbudC를 사용하세요. 1.4-1.5 단계를 반복하세요.
   참고: budC 는 2,3-부탄디올 탈수소효소를 암호화합니다. K. pneumoniae-ΔbudC 는 2,3-부탄디올 탈수소효소효소 활성을 잃고 2,3-부타네디올 대신 R-아세톤을 생성합니다.
3. 배양 온도는 pH 6.0, 37 °C로 유지하세요. 공기 보충 속도는 4L/min, 교반 속도는 450 rpm으로 사용되며, 이는 호기성 조건입니다.
   메모: 산소 보충량은 2,3-부탄디올 생산보다 높습니다.
4. 1.6단계에서 샘플을 분석하세요.

3. K. pneumoniae의 budA 돌연변이 체에 의한 2-케토글루코닉산 생성

1. 2-케토글루코닉산 생산에는 R-아세톤 생산과 동일한 매지를 사용하세요.
2. 2-케토글루코닉산 생산에는 K. pneumoniae-ΔbudA 를 사용하세요. 1.4-1.5 단계를 반복하세요.
   참고: budA 는 α-아세톨락테이트 탈카복실라제를 암호화합니다. K. pneumoniae-ΔbudA 는 α-아세톨락테이트 탈카복실라제 활성을 잃고 포도당을 기질로 사용하여 2-케토글루코닉산을 생성합니다.
   참고: 2-케토글루코닉산 합성은 산성 조건에 따라 달라지는 과정입니다. 2단계 발효법이 개발되어 2-케토글루코닉산 생산이 이루어졌으며; 1단계에서는 씨앗 배양물을 바이오리액터에 접종합니다.
3. 배양 온도는 pH 7.0, 37 °C로 유지하세요. 공기 보충 속도는 분당 4L, 저어주는 속도는 500 rpm입니다.
   메모: 이 조건에서 세포는 매우 빠르게 성장하며(약 4시간 만에 세포 밀도가 OD 7에 도달합니다). 그 후 발효는 2단계로 진행되며, 이 단계에서 배양 pH는 5.0까지 감소합니다. 산은 첨가되지 않으며; 배양에서 생성된 유기산은 자연스럽게 pH 감소를 초래합니다. 이러한 산성 조건에서는 세포 성장이 멈추지만, 2-케토글루콘산이 합성되어 육수에 축적됩니다.
4. 1.6단계에서 샘플을 분석하세요. 대나무의 가수분해물을 탄소원으로 사용합니다.
   메모: 배지 내 포도당은 2-케토글루코닉산으로 전환되고, 자일로스는 자일론산으로 전환됩니다. 따라서 2-케토글루코닉산과 자일론산의 혼합물이 얻어집니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
오토 클레이 브	산요	3780
바이오리액터	사르토리우스 스테딤 바이오테크	보스타트 아플러스
교반기	이카	RW 20
고성능 액체 크로마토그래프 시스템	시마즈 코퍼레이션	20AVP
대나무 가루	중국 저장성에서 구입함		메시 번호, 50
셀룰라제	생화학, 산둥, 중국		200 PFU/mL