S. aureus의 대사산물 분석을 위한 액체 크로마토그래피–질량분석법 기반 접근법

초록

출처: Samuels, D. J. 외 황 색포도상구균의 대사물 분석을 위한 액체 크로마토그래피-질량분석법 기반 탠덤 접근법. J. Vis. 경험 (2017)

이 영상은 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 S. aureus의 세포 내 대사산물을 식별하고 정량하는 방법을 보여줍니다. 대사물 추출, 펩타이드 정규화, 액체 크로마토그래피, 질량분석에 포함된 단계를 개괄합니다.

프로토콜

1. 대사물 추출

1. 젖은 얼음 위에서 해동 샘플을 추출하고, 균질기에서 6,000rpm에서 30초 버스 4회 분열을 가하며, 사이클 사이에 드라이아이스에서 2분간 냉각 시간을 가집니다.
2. 용해액을 미리 냉각된 냉장 마이크로 원심분리기에서 최대 속도(예: 18,213 x g, ≤4 °C)로 15분간 정액합니다.
3. 상원액을 깨끗한 마이크로 원심분리관으로 옮기세요.
4. 마이크로피펫을 사용해 샘플의 일부를 마이크로 원심분리관으로 옮겨 2단계에서 잔류 펩타이드 함량을 정량화합니다; 나머지는 -80°C에서 보관합니다.
   메모: 예약된 샘플의 부피는 2.1단계에서 사용되는 비신코닉산(BCA) 분석법에 따라 다릅니다. 이 샘플은 즉시 분석하기 위해 젖은 얼음 위에 보관하거나 -80 °C에서 냉동해야 합니다.

2. 비신코닉산(BCA) 분석

1. 키트 제조사가 권장하는 대로 BCA 분석법을 수행하며, 각 샘플의 잔류 펩타이드 농도를 측정합니다.

3. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)

1. 1.4단계에서 준비한 75 μL 황 색포도상구균 (S. aureus) 추출물과 75 μL LC-MS 용매 B를 혼합합니다.
2. 보텍스를 섞어 13,000 x g에서 5분간 돌립니다.
3. 상원액 100 μL을 액체 크로마토그래피(LC) 바이알에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 시료 내에 기포가 갇히지 않도록 하세요.
4. LC 바이알을 LC-MS 오토샘플러에 불러오고, "Offline Worklist Editor" 소프트웨어에서 실행 중인 목록을 편집하세요.
   1. "샘플 이름"(예: 야생형-1), "샘플 위치"(예: P1-A1), "방법"(예: 개미산 음성 방법), "데이터 파일"(예 : 야생형-1) 열을 작성하세요. "작업 목록 저장" 버튼을 클릭하세요. "질량분석법 데이터 획득 워크스테이션" 소프트웨어를 열고 이전에 저장했던 작업 목록을 입력하세요. "작업 목록 실행 시작" 버튼을 클릭하여 연속 LC-MS 측정을 시작하세요.
5. 샘플을 컬럼에 분리하고, 컬럼을 비행 시간(TOF) 분광기에 연결한 뒤, TOF 분광기를 LC 시스템과 결합합니다. 이동상 구배를 다음과 같이 사용하세요: 0-2분, 용매 B 85%; 3-5분, 80% 용매 B; 6-7분, 용매 B 75%; 8-9분, 용매 B 70%; 10-11.1분, 용매 B 50%; 11.1-14분, 용매 B 20%; 14.1-24분, 5% 용매 B; 85% 용매 B와 0.4mL ^min-1 유량에서 10분간 재평형 상태로 종료됩니다.
6. 이소크라틱 펌프를 사용하여 기준 질량 용액을 주입하여 동시 질량축 교정을 가능하게 합니다.
   메모: 이 단계는 표준 TOF 분광기 매뉴얼을 기반으로 합니다.
   1. 아세트산 D4와 헥사키스(1H,1H,3H-테트라플루오로프로폭시) 포스파진의 혼합물을 기준 질량 용액으로 사용하여 실시간 보정을 수행합니다. 주입에는 2.5 mL ^min-1 유량의 아이소크라틱 펌프를 사용하세요.

4. 이온 카운트의 배치 보정

1. 배치 교정을 위한 기준 샘플로 사용할 샘플을 지정하세요(예: 야생형, 복제 1).
2. 기준 시료 내 모든 대사산물의 이온 수를 합산합니다. 이 계산을 모든 샘플에 대해 반복합니다.
3. 각 샘플의 총 이온 수를 기준 샘플의 총 이온 수로 나누어 비율을 산출합니다.
4. 샘플 내 각 대사산물의 이온 수를 샘플/기준 비율로 나누어 배치 보정 이온 수를 얻습니다.

5. 펩타이드 정규화

1. 4단계에서 얻은 각 샘플의 배치 보정 이온 카운터 값을 2단계에서 BCA 분석으로 결정한 펩타이드 농도로 나누어 각 대사산물에 대한 정규화된 값을 얻습니다.
   메모: 5.1단계에서 얻은 각 대사산물의 정규화된 배치-배치 보정 이온 수는 균주간 직접 비교하여 통계 분석(예: Mann-Whitney U-검정)을 적용할 수 있습니다. 또는 치료나 유전적 배경에 의해 변화가 없는 대사산물을 정규화제로 사용하여 대사물 분해로 인한 변화를 감지할 수 있습니다. 추출 버퍼에 알려진 양의 L-노르발린 또는 글루타르산을 포함하면 시료 처리 중 손실을 보정하는 데 사용할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
재료/장비
충격 저항 튜브, 2 mL	USA 사이언티픽	1420-9600
실리카 비즈, 0.1mm	바이오스펙 프로덕츠 주식회사	11079101Z
Precellys 24 균질기	버틴 인스트루먼트	EQ03119-200-RD000.0
마이크로 BCA 단백질 분석 키트	피어스 (열사회)	23235
코젠트 다이아몬드 수소화물 C형 컬럼	애질런트	70000-15P-2
정확한 질량 비행 시간(TOF) LC-MS, 6200 시리즈	애질런트	G6230B
쿼트 펌프, 1290 시리즈	애질런트	G4204A
빈 펌프, 1290 시리즈	애질런트	G4220A
밸브 드라이브, 1290 시리즈	애질런트	G1107A
이소크라틱 펌프, 1290 시리즈	애질런트	G1310B
TCC, 1290 시리즈	애질런트	G1316C
샘플러, 1290 시리즈	애질런트	G4226A
서모스탯, 1290 시리즈	애질런트	G1330B
화학
인산염 완충 식염수 (pH 7.4) 10배	암비온	AM9624	신선한 물을 초순수한 물에 1배로 희석하세요
아세토니트릴	피셔 사이언티브	A955-500	옵티마 LC-MS
개미산	시그마 올드리치	94318	질량분석은 98%
매스헌터	애질런트	G3337AA
박테리아 균주	종	거르다	유전자 형
SRB 337	황색포도상구균	USA200 MSSA UAMS-1	야생형
SRB 372	황색포도상구균	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm