자동화된 미생물반응기를 이용한 다양한 배지 제형에서 박테리아 성장 모니터링

초록

출처: 헤머리히 J. 외 자동화된 미생물반응기 기술을 이용한 이종 단백질 생산 최적화 프로토콜. J. Vis. 경험 (2017).

이 영상은 다양한 배지 제형에 반응하여 박테리아 성장과 형광 단백질 분비를 모니터링하기 위해 자동화된 미생물 반응기를 사용하는 방법을 시연합니다. 분비성 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아는 항생제 선별 하에 배양되어 영양분이 다양한 웰에 접종됩니다. 세포 밀도와 형광의 실시간 광학 측정은 다양한 성장 조건에서 단백질 생산을 비교 분석할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 재료 준비 및 정의 절차
메모: 실험 방법을 상세히 정의하고 고정하는 것이 권장됩니다. 이러한 표준화는 서로 다른 결과가 내재적 생물학적 변이성이나 매질 조성 차이에서 비롯될 수 있도록 보장합니다. ​
메모: 미디어 스톡 솔루션: 모든 조사 미디어 구성 요소에 대해 개별 스톡 솔루션을 준비하세요. 모든 성분의 다양한 부피를 희석할 수 있도록 고농축 재고를 준비하세요. 즉, 설계 계획에 따라 모든 재고 용액을 최대 부피로 결합한 후에는 최종 배양 부피를 초과할 수 없습니다(참조: "중간 용액 피펫팅 목록 생성" 1.3.3 단락 참조 ). 고농축 용액을 첨가했을 때 최종 배양량의 1/100 정도로 매우 적은 부피 가 < 경우 , 재고 용액을 적절히 희석합니다. 예를 들어, 본 연구에서는 10 μL 미만의 피펫팅 부피는 실행 불가능하다고 정의되었습니다. 일반적으로 미량 원소 용액은 매질 내 최종 표준 농도에 비해 최대 1,000배까지 농축됩니다. 기준 레시피에서 농도에 비해 배수(X-폴드)로 농축하는 것이 유리합니다. 이렇게 하면 소수점 분수의 비현실적인 피펫팅 부피를 피할 수 있습니다. 모든 CgXII 매개체 용액의 상세 레시피는 보충 문서에 제공되어 있습니다.

1. 작동 셀 뱅크(WCB)
참고: 각 성장 실험마다 하나의 WCB 분할 할당량이 사용됩니다. 더 많은 분할 용량이 필요하다면, 1,000 mL 배플드 쉐이크 플라스크에 100 mL 뇌심장 주입(BHI) 배지를 사용하거나, 글리세롤 용액을 첨가하기 전에 여러 개의 쉐이크 플라스크를 모아 접종합니다.

1. 재조합 발현 균주 C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43의 단일 콜로니를 한천 플레이트(37 g/L BHI 분말, 20 g/L 한천, 25 mg/L 카나마이신)에서 준비합니다. 도금 재료는 신선한 변형에서 나오거나 냉동 보존된 알리코트에서 나올 수 있습니다. 30°C에서 단일 군집이 나타날 때까지 배양합니다; 보통 이틀 정도 걸립니다.
2. 셰이커 플라스크 배양(50 mL BHI 배지에 25 mg/L 카나마이신, 500 mL 배플드 플라스크, 250 rpm, 25mm 쉐이킹 직경, 30 °C)에 콜로니 물질과 함께 접종하고 하룻밤(약 16시간) 배양합니다.
3. 결과 세포 현탁액 1부피와 500 g/L 멸균 글리세롤 용액 1부피를 혼합하여 멸균 냉동 보존 바이알에 2 mL 알리코트로 분포합니다. -80°C에서 보관하세요.

2. MBR 배양 프로토콜
메모: 본 연구에서 사용된 BioLector MBR 시스템의 경우, 산란광(바이오매스)과 GFP 형광은 강도 측정값으로, 일정한 이득 값이 할당되어야 합니다. 이득이 높을수록 광 신호가 더 크게 증폭되고; 이것이 산란광과 형광을 임의의 단위(A.U.)로 측정하는 이유이기도 합니다. 예비 실험에서 바이오매스 및 GFP 검출에 적합한 이득 값을 결정하고, 후기 공정 단계에서 높은 바이오매스 농도에서 산소 제한을 피할 수 있도록 적절한 흔들림 빈도와 충전 부피를 결정합니다. 사용된 재배 조건("플라워플레이트", 즉 꽃 모양의 48웰 MTP, 1,200rpm의 진동 주파수, 1,000 μL의 충전 부피, 주요 탄소원은 10 g/L 포도당)은 산소 무제한 배양을 보장했습니다. 꽃 모양 48웰 MTP에서 충전량과 진동 주파수의 다른 조합으로 인한 최대 산소 전달 속도를 위해서는 공급업체에서 제공하는 데이터시트가 제공됩니다. 또한, 개별 배양균의 성장 결함은 2차 기질(예: 질소, 미량 원소)의 적은 양으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서 재배 종료 시 바이오매스 농도를 확인하세요. 이 연구에서는 그러한 성장 효과가 관찰되지 않았습니다.

1. MBR 시스템("BioLector")의 재배 프로토콜을 다음과 같이 정의합니다:
2. 필터 세트 1: 바이오매스, 14 증가. 필터 세트 2: pH, 게인은 미리 설정되어 있습니다. 필터 셋 3: pO2, 게인은 미리 설정되어 있습니다. 4: GFP, 80 증가.
3. 진동 주파수: 1,200 rpm.
4. 기온: 30 °C.
5. 주기 시간: 15분.
6. 실험 시간: 수동 (재배는 자동으로 중단되지 않음).

3. 중간 용액 피펫팅 목록 생성
메모: 거의 모든 액체 취급 로봇 시스템은 외부 파일에서 피펫팅 작업을 읽을 수 있습니다. 기본적으로 필요한 최소 정보는 시약 원천의 전송 부피와 위치, 그리고 각 시약의 목적지(로봇 데크 내 실험실 도구의 위치와 실험실 내 특정 공동)입니다. 하지만 액체 취급 시스템마다 서로 다른 문법을 고려해야 합니다. 그림 1 은 본 연구에서 사용된 피펫팅 시스템의 예시 파일 구조를 보여줍니다.

1. 네 가지 유형의 용액이 각 배양 웰에 피펫으로 주입됩니다:

1. 다양한 매체 성분의 스톡 용액("변이스 스톡").
2. 위 자원들의 누적 부피 차이를 보상하기 위해 물을 공급합니다.
3. 고정된 모든 부품을 포함하는 스톡 솔루션("Rest Stock")입니다. 이 스톡 용액은 서로 다른 온도에서 보관되거나 서로 다른 방법으로 멸균된 성분을 포함한 스톡으로 구성될 수 있습니다.
4. 접종물은 마지막 성분으로 추가하여 작업 테이블 위에 올려 세포가 침전하지 않도록 해야 합니다.

2. 경배정 각 각 매체 구성 요소별로 전송할 부피를 다음과 같이 계산한다:

특정 변형 스톡 에 대해 추가해야 할 부피는 0일 수 있는데, 즉 이 특정 성분이 생략될 때입니다.

3. 모든 계산 부피 Vi 를 적절한 수치로 수정한다. 피펫팅 부피 단계 증가는 너무 작아서는 안 됩니다. 필요하다면 변동 주식의 농도를 조정하세요. 예를 들어, 여기서 최소 피펫팅 부피는 10 μL로 정의되었고, 최소 증가량은 5 μL로 정의되었습니다. 일반적으로 이 부피들은 사용 액체 취급 스테이션의 실험적으로 측정된 정밀도와 정확성을 기준으로 정의되어야 합니다.

4. 모든 우물의 고정 성분을 포함하는 여지 재고 의 부피를 다음과 같이 계산한다:

여기서 변동 스톡 의 최대 누적 부피가 사용됩니다. 따라서 Rest Stock 에 고정된 성분의 요구되는 농도를 다음과 같이 계산합니다:

그에 맞게 레스트 스톡 을 준비하세요.

5. 경작 우물별 첨가물 부피를 다음과 같이 계산합니다:

6. 재배 우물별로 추가할 모든 부피를 다음 순서로 나열하세요: V_H2O, V_RestStock, V_i, V_Inok. 예를 들어 그림 1에 나타난 액체 취급 스테이션의 사양에 따라 피펫팅 목록을 포맷하세요.

2. 종자 배양, 자동 배지 준비, 그리고 주 배양 시작

1. 액체 취급 로봇을 위한 프로토콜을 만들어. 해당 "WinPREP" 소프트웨어로 구현된 "Janus" 시스템의 예시 프로토콜은 그림 2 와 그림 3 을 참조하세요. 프로토콜은 다음 측면을 고려해야 합니다:

1. 배지 준비 전에 충분한 멸균 하우징 사용 시간을 포함할 것.

2. 모든 피펫팅 팁과 튜빙을 초기로 과도하게 세척하고 세척하세요.

3. 재고 용액에 적합한 실험실 용기를 선택하세요. 여기서는 12개의 컬럼이 있는 깊은 웰 플레이트가 변형 스톡 저장에 적합하며, 8개의 피펫팅 팁 모두가 웰 컬럼에 병렬로 담글 수 있습니다. 이로 인해 미디어 준비가 크게 빨라집니다. 15 mL 또는 50 mL 시약 튜브를 저장소로 사용할 경우, 한 번에 한 개의 피펫팅 팁만 담글 수 있습니다. 물과 레스트 스톡 같은 다른 스톡의 경우, 100 mL 트로프가 사용되는데, 이 스톡 용액들은 총 용량이 더 많기 때문입니다.

4. 폐기물 양, 피펫팅 높이 오프셋 등을 보상할 수 있도록 각 스톡 용액에 충분한 총 부피를 제공한다 .

5. 접종 단계 전에 사용자 프롬프트를 삽입하여 이 단계가 씨앗 배양 절차 직전에 수행되도록 합니다.

2. 모든 정액을 멸균 상태로 준비하고, 사용 전까지 적절한 용기( 예: 멸균 15 mL 및 50 mL 시험관)에 보관하세요.
3. 작업대에서 저장할 때 깊은 웰 플레이트를 멸균하여 70% 에탄올로 닦은 후 층류 후드에서 건조합니다.
4. 씨앗 배양은 WCB에서 추출한 알리코트 1개와 함께 25 mg/L 카나마이신이 함유된 50 mL BHI 배지를 접종하여 시작한다. MBR 재배 전에 기하급수적으로 성장하는 종자 배양에서 신선하고 중요한 접종물을 충분한 양으로 준비하세요.
5. 필요한 모든 실험실 도구를 로봇 작업대 위에 놓고, 해당 실험실 도구에 재고 용액을 부어주세요.
6. 배지 준비를 위한 로봇 워크플로우를 시작하여 종자 배양 시작 시점에 마지막 단계(접종)에 도달하도록 합니다. 로봇 워크플로우의 전체 실행 시간은 사전에 평가되어야 합니다. 이 작품의 총 상영 시간은 약 1.5시간이었습니다.
7. 약 2시간 후, 그 후 1시간마다 시료를 채취하여 광학 밀도(OD₆₀₀)로 성장 상태를 모니터링합니다. 약 5시간 후 배양 수치는 3-4 OD₆₀₀ 에 도달하여 주요 배양 접종에 사용됩니다.
8. 씨앗 배양물을 액체 취급 작업대 위에 올려놓고 배지 준비 절차를 계속하세요. 접종 후 물개 재배 MTP를 사용하세요.
9. 밀봉된 재배 MTP를 BioLector 장치에 넣고 미리 정의된 배양 프로토콜을 시작하세요.
10. 필요하다면 생물안전 규정에 따라 남은 재고 용액을 폐기하고, 로봇 작업대에서 배양물을 씨앗 배종합니다. 재사용 가능한 실험실 기구를 청소하고 액체 핸들러 오염 제거 절차를 시작하세요.

결과

그림 1: 감도 분석을 위한 볼륨 피펫팅 목록 스크린샷. 첫 번째 열의 항목은 행의 모든 볼륨에 고유 식별자를 할당합니다; 이 식별자는 액체 처리 작업대에서 목표 배양 MTP의 MTP 우물 번호입니다 . 참고: 그림 3C. 나머지 열은 피펫화할 다양한 용액('Sln-01'에서 'Sln-15')의 부피를 인코딩합니다. 한 줄의 누적 부피는 해당 우물의 최종 경배 부피에 해당합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
바이오렉터	M2P-Labs	G-BL-100
플라워플레이트	M2P-Labs	MTP-48-BOH	바이오렉터 장치에서 배양할 때
밀봉 호일	M2P-Labs	F-GP-10	플라워플레이트의 멸균 밀봉
MATLAB	수학 작품	2016b
크리킷	Forschungszentrum Jülich	해당 없음	무료로 이용 가능하며, MATLAB 설치 필요
야누스 피페팅 로봇	퍼킨 엘머	해당 없음	"WinPrep" 소프트웨어 설치 포함
12컬럼 딥 웰 마이크로플레이트	E&K 사이언티픽	EK-2034	중간 용액 용액
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	해당 없음	해당 없음	발현 삽입물로 pEKEx2 플라스미드를 운반하며, B. subtilis에서 GFP 유전자와 PhoD 신호 펩타이드가 융합되어 있습니다. 플라스미드는 카나마이신 내성을 제공합니다. Meissner 외, Appl Microbiol Biotechnol, 76 (3), 633–42 (2007)에 의해 기술 및 발표됨