출처: 리아-스미스, D. J. 외 모델 남세균 종에서 표지 및 표지 없는 돌연변이체 생성. J. Vis. 경험 (2016)
이 영상은 농축된 세포 현탁액을 글리세롤 또는 DMSO와 결합하여 저온에 저장하여 시아노박테리아 균주를 냉동 보존하는 과정을 시연하며, 광합성과 유전 연구를 위한 생존 가능한 배양물을 장기 유지할 수 있게 합니다.
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방법 논문
글리세롤 또는 디메틸 설폭사이드를 이용한 시아노박테리아 균주의 장기 냉동 보존
489 조회수
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2025년 11월 28일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 배양 매체 준비
- BG11 미디엄 준비하세요
- 100배 BG11, 미량 원소, 철 원소를 혼합한 스톡 용액을 준비합니다(표 1).
- 인산염 스톡, 탄산나트륨(Na2CO3), 스톡 N-[트리스(하이드록시메틸)메틸] -2-아미노에탄설폰산(TES) 버퍼, 그리고 중탄산나트륨(NaHCO3)을 각각 별도의 용액으로 준비합니다(표 1).
- 인산염과 Na2CO3 스톡을 오토클레이브합니다. 0.2 μm 필터로 TES 버퍼와 NaHCO3를 필터 멸균합니다.
- BG11을 물 976ml, 100x BG11 10ml, 미량 원소 1ml, 철 스톡 1ml를 섞어 오토클레이브하여 준비합니다. 이 용액이 실온에 식은 후에는 인산염 스톡 1ml, Na2CO3 스톡 1ml, NaHCO3 10ml를 추가합니다.
- BG11 고체 배지의 경우, 플라스크 한 개에 한천 15g과 물 700ml를 넣으세요. 두 번째 플라스크에 티오황산나트륨 3g(Na2S2O3), 물 226ml, 100x BG11 10ml, 미량 원소 1ml, 철제 1ml를 추가합니다. 두 가지 모두 오토클레이브하세요. 이 용액들이 실온까지 식은 후, 인산염 스톡 1ml, Na2CO3 스톡 1ml, TES 버퍼 10ml, NaHCO3 10ml를 추가하여 혼합합니다.
메모: 특정 염분 침전을 피하기 위해 용액은 별도로 준비됩니다.
- 자당 선택을 위해 50% (w/v) 자당 용액을 준비하세요. 0.2 μm 필터로 용액을 멸균한 후 BG11(50% 자당 100ml에 BG11 900ml)을 첨가하여 BG11/5% 자당 플레이트를 만듭니다.
메모: NaHCO3 는 BG11/5% 자당 한천 플레이트에 첨가하지 마세요. 평소처럼 나소나슘2, 일산화탄소3 을 추가하세요. - 시네코코커스 배양을 위해, 10ml의 1M 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N′-(2-에탄설폰산)(HEPES), 비타민 B12 1ml(표 1)를 BG11 배지 1L에 첨가합니다.
메모: 상업적으로 이용 가능한 BG11 배지에서 배양된 균주를 변형하는 것은 여기서 설명한 BG11 배지 레시피보다 효율이 현저히 떨어져 권장되지 않습니다.
2. 균주들의 장기 저장
- 세포 루프를 30-50ml BG11 배지에 접종시켜 신선한 배양을 시작하세요. 배양물을 3-4일간 OD750nm = 0.4에서 0.7까지 배양합니다.
- BG11로 세포를 한 번 세척한 후 ~2ml의 BG11에 재현탁합니다.
- 한 튜브에 농축 세포 0.8ml를 추가하세요. 그 다음 80% 필터 멸균 글리세롤 0.2ml를 추가하세요.
- 선택적으로: 농축된 세포 0.93ml를 다른 튜브에 추가하세요. 이 튜브에 DMSO 0.07ml를 추가하세요.
주의: DMSO는 독성이 강하므로 적절한 보호를 받아 다뤄야 합니다. - 두 튜브 모두 -80 °C에서 보관하세요. 균주를 되살리려면, 항생제가 없는 한천 플레이트에 튜브를 제거하고 무딘 이쑤시개로 세포를 긁어내세요. 멸균 루프를 사용해 평소처럼 스트라이크를 하세요.
표 1: 이 연구에서 사용된 해법
| 스톡 용액 레시피 | |
| 화학 | 금액 (g) |
| 100개의 BG11 (L당 기준) | |
| NaNO3 | 149.6 |
| MgSO4.7H 2O | 7.49 |
| CaCl2.2H 2O | 3.6 |
| 구연산 | 0.6 |
| 1.12ml 첨가 0.25M Na2EDTA, pH 8.0 | |
| 0.25 M Na2EDTA, pH 8.0 (100 ml당 ) | |
| Na2EDTA | 9.3 |
| 미량 원소 (100ml당 기준) | |
| H3BO3 | 0.286 |
| MnCl2.4H 2O | 0.181 |
| ZnSO4.7H 2O | 0.022 |
| Na2MoO4.2H 2O | 0.039 |
| CuSO4.5H 2O | 0.008 |
| Co(NO3)2.6H 2O | 0.005 |
| 철 스톡 (100ml당 기준) | |
| 페릭 암모늄 시트레이트 | 1.11 |
| 인산염 토축액(100ml당 기준) | |
| K2HPO4 | 3.05 |
| Na2CO3스톡 (100ml당 ) | |
| 나,2, CO3 | 2 |
| TES 버퍼, pH 8.2 (100ml당 | |
| 오 셨 | 22.9 |
| NaHCO3 스톡 (100ml당 ) | |
| NaHCO3 | 8.4 |
| HEPES, pH 8.2 (500ml당 ) | |
| 젠장 | 119.15 |
| 비타민 B12 (50ml당 기준) | |
| 시아노코발라민 | 0.02 |
| 루리아 베르타니 매체 (500ml당 기준) | |
| 루리아 베르타니 육수 | 12.5 |
| 1 M MgCl2 (100 ml당 ) | |
| MgCl2.6H 2O | 20.33 |
| 용액 A (200ml당 ) | |
| MnCl2.4H 2O | 0.395 |
| CaCl2.2H 2O | 1.47 |
| 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 하이드레이트, 4-모르폴린에탄설폰산(MES) | 0.4265 |
| 용액 A + 글리세롤 | |
| 10ml 용액 A | |
| 1.5ml 글리세롤 | |
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 나노₃ | 시그마 | S5506 | |
| MgSO₄·7H₂O | 시그마 | 230391 | |
| CaCl₂ | 시그마 | C1016 | |
| 구연산 | 시그마 | C0759 | |
| Na₂EDTA | 어부 | EDT002 | |
| H₃BO₃ | 시그마 | 339067 | |
| MnCl₂·4H₂O | 시그마 | M3634 | |
| ZnSO₄·7H₂O | 시그마 | Z4750 | |
| Na₂MoO₄·2H₂O | 시그마 | 331058 | |
| CuSO₄·5H₂O | 시그마 | 209198 | |
| Co(NO₃)₂·6H₂O | 시그마 | 239267 | |
| 페릭 암모늄 시트레이트 | 시그마 | F5879 | |
| K₂HPO | 시그마 | P3786 | |
| Na₂CO₃ | 어부 | SODC001 | |
| 오 셨 | 시그마 | T1375 | |
| NaHCO₃ | 어부 | SODH001 | |
| 젠장 | 시그마 | H3375 | |
| 시아노코발라민 | 시그마 | 47869 | |
| Na₂S₂O₃ | 시그마 | 72049 | |
| 백토 한천 | BD | 214010 | |
| 자당 | 어부 | SUC001 | |
| 페트리 접시 90mm 삼중 통풍 | 그라이너 | 633185 | |
| 0.2 μm 필터 | 사르토리우스 | 16534 | |
| 100ml 원뿔형 플라스크 | 파이렉스 | CON004 | |
| 파라필름 M 100mm x 38m | 베미스 | FIL003 | |
| 푸전 고충실도 DNA 중합효소 | 퓨전 | F-530 | |
| 아가로스 | 멜포드 | MB1200 | |
| DNA 정제 키트 | 모비오 | 12100-300 | |
| 제한 엔도뉴클레아제 | NEB | ||
| T4 리가제 | 써모 사이언티픽 | EL0011 | |
| 루리아 베르타니 육수 | 인비트로젠 | 12795-027 | |
| MES | 시그마 | M8250 | |
| 카나마이신 황산염 | 시그마 | 60615 | |
| 암피실린 | 시그마 | A9518 | |
| GeneJET 플라스미드 미니프렙 키트 | 써모 사이언티픽 | K0503 | |
| 14ml 둥근 바닥 튜브 | BD 팔콘 | 352059 | |
| 고탁 G2 플렉시 DNA 중합효소 | 프로메가 | M7805 | |
| 425-600 μm 유리 구슬 | 시그마 | G8772 | |
| 글리세롤 | 시그마 | G5516 | |
| DMSO | 시그마 | D8418 | |
| 형광등 | 그로-럭스 | 69 | |
| HT 멀티트론 광생물반응기 | 인포 |
