respirometric 산화 인산화 분석과 함께 사포닌 - permeabilized 섬유 준비 mitochondrial 기능의 통합 평가를 제공합니다. 생리학 및 병리 학적 상태에서 Mitochondrial 호흡은 mitochondrial 상호 작용, 형태학 및 생화학 등 다양한 규제의 영향을 반영하실 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
mitochondria가 에너지 대사, 산화 스트레스, apoptosis, 노화, mitochondrial encephalomyopathies 및 약물 독성에 관련된으로 mitochondrial 기능의 조사는 심장 생리학의 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 이것을 감안할 때, 심장 mitochondrial 기능을 측정하는 기술 수요에 있습니다. mitochondrial 기능을 측정하는 통합 접근 방식을 채택 한 기술은 respirometric 산화 인산화 (OXPHOS) 분석입니다.
respirometric OXPHOS 평가의 원칙은 클락 전극을 이용하여 산소 농도를 측정 중심이다. permeabilized 섬유 번들 폐쇄 챔버 감소에 산소, 산소 농도를 소모로. 선택된 기판 - 억제 - uncoupler 적정 프로토콜을 사용하여, 전자는 mitochondrial 기능의 평가를 허용, 전자 수송 사슬의 특정 사이트에 제공됩니다. , mitochondrial 함수의 respirometric 분석하기 전에 기계적 및 화학적 준비 기술은 근육 섬유의 sarcolemma을 permeabilize로 활용하고 있습니다. 화학 permeabilization는 세포 구조를 유지하면서 선택적으로 세포막을 구멍에 사포닌 고용합니다.
본 논문은 철저히 mitochondrial OXPHOS을 평가하기 위해 산소 소비 측정에 대한 사포닌 피부 심장 섬유 준비에 관련된 단계를 설명합니다. 또한, 조언뿐만 아니라 특정 기판 문제 해결, 전자 수송 사슬의 특정 사이트에서 mitochondria 기능을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 저해제와 uncouplers이 제공됩니다. 중요한 것은 설명 프로토콜은 쉽게 다양한 동물 모델과 인간의 샘플의 심장과 골격 조직에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 시약 준비
- 이전에 사소한 수정 1 설명된대로 휴식과 보존 용액 (RP 솔루션)이 준비됩니다. 간단히, RP 솔루션 조정 2.77mM CaK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20mM 이미다졸, 0.5mM dithiothreitol, 20mM 타우린, 50mM K - MES, 6.56 MgCl 2, 5.7mM ATP, 14.3mM phosphocreatine, 산도 7.1로 구성되어 있습니다 실온 (RT)에서. 소독에 0.45 - μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. -20 15 ML 부분 (팰컨 폴리 프로필렌 튜브)와 저장소로 나누어 ° C 조리법에 대한 논의를 참조하십시오.
- Mitochondrial Respirometry 솔루션 (MiR05)는 이전에 2 설명된대로 준비 및 60mM 칼륨 - lactobionate, 110mM 0.5mM EGTA, 3mM MgCl 2 0.6 H 2 O, 20mM 타우린, 10mM KH 2 PO 4, 20mM HEPES, 1g / L BSA를 포함합니다 30 조정 자당, 산도 7.1 ° C. 소독에 0.45 - μm의 필터를....
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토론
사포닌 - permeabilized 심장 섬유 기술은 체외에서 mitochondrial OXPHOS 산소 소비의 생체내 평가 사이에 독특한 타협을 제공합니다. 이 기법의 장점은 보존되어 있습니다 셀룰러 아키텍처로 격리 mitochondria에 비해 생리 관련을 증가 등이 있습니다. 플라즈마 막이 저하되는 동안, mitochondria 12를 포함하여 세포 멤브레인 구조, 14, sarcoplasmic reticulum 14, 근육 섬 유지 및 cytoskeleton 1, 17 그대로 남아 있습니다. 또한, mitochondria 및 cytoskeleton 일, 17 사이의 상호 작용도 변형입니다. permeabilized 섬유의 Mitochondria가 증가 안정성을 보여줍니다. 설치류 섬유 준비는 최대 24 시간 18,2하는 안정성을 보여주 6h 인간 섬유 샘플.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 건강 연구와 게놈 캐나다의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. JS는 의료 연구, 심장과 캐나다의 행정 재단과 캐나다 당뇨병 협회 앨버타 헤리티지 재단의 급여 지원 수상 경력을 보유하고 있습니다. 실험실은 사포닌 - permeabilized 섬유 기술의 인수 중에 Oroboros 악기의 기술 지원을 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100% 에탄올 | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% 에탄올 | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| esencially fatty acid–free 우혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| 아스코르브산 | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| 탄산칼슘 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| 글루탐산 | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 이미다졸 | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 케타민 | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| 락토바이오닉산 | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| 염화마그네슘 (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| 염화마그네슘 6수화물 (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| 말산 | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| 염화칼륨 | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 수산화칼륨 | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| 시안화칼륨 | Fluka | 60178 | |
| 인산일수소칼륨 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| 펜토바르비탈 나트륨 | Ceva Sante Animale | 1715 138 | 농도 54.7 mg/ml |
| 피루브산 나트륨 | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 숙신산 | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| 자당 | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| 타우린 | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| 자일라진 | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| 얼음 | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| 킴와이프스 | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브 | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브 | VWR international | 89004-364 | |
| 직선형 정밀 핀셋 | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| 곡선형 정밀 핀셋 | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| 직선형 수술용 가위 | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| 멸균 수술용 메스 날 | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm 시린지 필터 | VWR international | CA28145-485 | |
| pH 미터 | VWR international | CA11388-308 | |
| 유리 페트리 접시 | VWR international | 89000-300 | |
| 12-웰 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 | VWR international | 82050-926 | |
| 플레이트 교반기 | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand 마그네틱 바 | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| 전자저울 | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton 마이크로 시린지 | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton 마이크로 시린지 | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton 마이크로 시린지 | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene 세척병 | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| 폴리스티렌 칭량 접시 | VWR international | 89106-750 | |
| 해부 현미경 | Olympus Corporation |
참고문헌
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , S....
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