분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Biofilms, 의료 산업 및 자연 환경 설정에서 찾을 수 표면에 부착된 미생물의 커뮤니티입니다. 사실, biofilm의 생활은 대부분의 환경에서 미생물의 성장의 predominate 모드를 나타냅니다. 성숙 biofilms 몇 가지 뚜렷한 특징이있다. Biofilm의 미생물은 일반적으로 구조와 지역 사회에 보호 기능을 제공합니다 세포외 기질에 둘러싸여 있습니다. biofilm의 성장 미생물은 일반적으로 유체 - 채워진 채널 둘러싸인 macrocolonies (수천개의 세포를 포함)로 구성된 특성 아키텍처를했습니다. Biofilm - 재배 미생물은 또한 임상 관련 항생제를 포함하여 항균 대리인의 범위에 그들의 저항에 대한 악명 있습니다.
microtiter 접시 분석은 biofilm 형성의 초기 단계의 연구를위한 중요한 도구이며,이 분석은 또한 곰팡이 biofilm 형성을 연구하는 데 사용되었지만, 세균성 biofilms 연구 주로 적용되었습니다. 이 분석은 정적, 배치 성장 조건을 사용하기 때문에, 그것은 일반적으로 흐름 전지 시스템과 관련된 성숙한 biofilms의 형성에 대한 허용하지 않습니다. 그러나, 분석이 잘 세포외 다당류의 생산에 관련된 유전자와 같은 biofilm 형성의 개시 (즉, flagella, 필리, adhesins, 주기적 - DI - GMP 바인딩과 대사에 관여하는 효소)에 필요한 여러 가지 요인을 식별에 효과가있다. 또한 게시된 작품은 microtiter 요리 재배 biofilms은 면역 시스템 effectors 이러한 항생제 내성 및 저항을 성숙 biofilms의 일부 속성을 개발 할 것을 나타냅니다.
이 간단한 microtiter 접시 분석은 벽 및 / 또는 microtiter 접시의 바닥에 biofilm의 형성 수 있습니다. 분석의 높은 처리량 자연은 유전자 화면에 유용합니다뿐만 아니라, 다양한 성장 조건 하에서 여러 변종에 의해 시험 biofilm 형성합니다. 이 분석의 변종은 미생물을 포함한 다양한위한 초기 biofilm 형성을 평가하는 데 사용되지만 pseudomonads, 비브리오 cholerae, 대장균, staphylocci, enterococci, mycobacteria 및 곰팡이, 이에 국한되지 않음되었습니다.
프로토콜 여기에서 설명한에서, 우리는 모델 유기체 녹농균의 biofilm 형성을 연구하기 위해이 분석의 사용에 초점을 맞출 것이다. 이 분석에서, biofilm 형성의 범위는 염료 크리스탈 바이올렛 (CV)를 사용하여 측정됩니다. 그러나, 다른 colorimetric 및 신진 대사 얼룩의 번호는 microtiter 접시 분석을 사용하여 biofilm 형성의 부량에 대한보고되었습니다. microtiter 접시 분석의 용이성, 저렴한 가격과 유연성은 biofilms 연구를위한 중요한 도구가되었다.
프로토콜
1. Biofilm 성장을
- 야생 형 녹농균이나 풍부한 매체 박 이상의 돌연변이 스트레인 (즉, LB)의 문화를 성장
- biofilm의 assays를위한 새로운 매체로 통해 밤 문화를 희석 1:100. P.위한 표준 biofilm 분석 매체 녹농균이라는 박테리아는 황산 마그네슘, 포도당 및 casamino의 지방산 (표 참조) 보충 M63 최소한의 매체입니다. 대안 biofilm - 증진 적은 planktonic의 성장과보다 강력한 biofilm, 포도당 및 casamino의 지방산을 자극 매체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 아르기닌으로 대체 될 수 있듯이.
- 96 잘 접시에 잘 희석 당 100 μL를 추가합니다. 정량 assays을 위해, 우리는 일반적으로 각각의 치료를 위해 4-8 복제 우물을 사용합니다.
- 37 4-24 시간에 대한 microtiter 접시를 품어 ° C.
2. Biofilm 스테 이닝
- 부화 후 판을 뒤집어하고 액체를 흔들어하여 세포를 덤프.
- 물이 작은 욕조에 부드럽게 잠수함 접시 (즉, 욕조 등 P1000 pipetmen에 대한 피펫 팁 상자의 바닥을 사용....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 방법은 미생물 종의 다양한 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 비 운동성이있는 미생물은 일반적으로 우물의 바닥을 준수하면서 운동성이있는 미생물은 일반적으로, 벽 및 / 또는 우물의 바닥을 준수. biofilm 형성 (즉, 성장 매체, 온도, 부화의 시간)에 대한 최적 조건은 각각의 미생물에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 나는 각각의 접시에 부정적인 컨트롤을 여러 개 수행하는 각각의 변형이나 조건 (4-8)의 복제, 그리고 긍정적인 컨트롤을 포함시키는 것이 좋습니다, 그리고 가능하다면.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
셰리 Kuchma, 피터 뉴웰과 그림 1의 이미지를 제공 로버트 샨크츠 내 주셔서 감사합니다. 이 작품은 GAO에 NIH 부여 R01AI083256 지원했습니다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 X M63 | 15g의 KH2PO4를 녹여 5X M63 스톡 용액으로 준비하십시오.2PO4, 35g K2하이퍼파라미터 최적화(HPO)4 및 10g (NH4)2SO4 물 1L에 녹입니다. 이 스톡 용액은–고압증기멸균할 필요가 없으며 실온에서 보관할 수 있습니다. 5X 스톡 용액을 1:5로 희석하여 고압증기멸균하고 냉각한 후, 필요한 성분들을 첨가하십시오. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2하이퍼파라미터 최적화4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| 황산마그네슘 | Fisher Scientific | M63-500 | 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하십시오. 증류수에 1 M 스톡 용액으로 조제하여 오토클레이브 멸균하십시오. |
| 포도당 | Fisher Scientific | D16-3 | 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하십시오. 증류수에 20% 농도의 스톡 용액으로 조제하여 오토클레이브 멸균하십시오. |
| 카자미노산 | BD Biosciences | 223050 | 최종 농도가 0.5%가 되도록 첨가하십시오. 증류수에 20% 스톡 용액으로 조제하여 오토클레이브 멸균하십시오. |
| 아르기닌 | Sigma-Aldrich | A5131 | 최종 농도가 0.4%가 되도록 첨가하십시오. 증류수에 20% 스톡 용액으로 조제한 후 여과 멸균하십시오. 이 대체 탄소/에너지원은 포도당과 카사미노산을 대체하여 사용할 수 있습니다. |
| 마이크로타이터 플레이트 | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, 유연한 분석 플레이트, 96 웰, U자형 바닥, 비멸균, 비조직배양 처리. |
| 마이크로타이터 플레이트 덮개 | BD Biosciences | 353913 | 뚜껑은 95% 에탄올 수용액으로 세척하여 재사용할 수 있습니다. |
| 크리스탈 바이올렛 | Sigma-Aldrich | 229641000 | 증류수에 0.1% 용액으로 준비하십시오. |
참고문헌
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
