제브라피시 모델을 이용한 마이코박테리아 감염에서 숙주 면역의 역할 평가

초록

출처: Luukinen, H. 외. Mycobacterium marinum 에 감염된 성체 제브라피시에서 결핵 모델링. J. Vis. 경험 (2018).

프로토콜

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 복막 내 주사를 통한 실험적 M. marinum 감염

1. 희석된 박테리아 용액 5μL 방울을 파라필름 필름에 피펫 흡입한 후 30G 인슐린 바늘에 당겨 넣습니다.
2. 실험에는 5–8개월 된 야생형 어류와 rag1−/−hu1999 돌연변이 물고기를 사용하세요. 수조 내 수역에서 성체 제브라피시를 0.02% 3-아미노벤조산 에틸 에스터(pH 7.0)로 마취하세요. 물고기 배를 위로 향하게 하여 젖은 폼 플라스틱 위에 슬릿을 넣습니다.
   참고: Rag-/- 돌연변이 어류는 체세포 재조합을 겪지 못해 기능성 T 및 B 세포를 생성할 수 없습니다.
3. 골반지느러미 사이에 바늘을 약 45° 각도로 주입하세요. 바늘 구멍을 위로 향하게 하여 전체 구멍이 복강 안에 있는지 확인하세요. 천천히 박테리아 현탁액을 주입하고 조심스럽게 바늘을 제거하세요.
   참고: 주입 시 붉은 추적자가 물고기에서 새어나오면 실험에서 제외하세요.
4. 주입 직후에는 신선한 물이 담긴 회수 수조로 물고기를 옮기세요.
5. 사용 중인 박테리아 알리코트에서 7H10 플레이트에 세균 현탁액을 15분마다 채취해 29°C에서 5일간 배양한 뒤, 플레이트에 적힌 군락 수를 세어 감염 용량을 확인하세요.
6. 물고기의 상태를 정기적으로 점검하고, 감염 증상이 있는 물고기는 3-아미노벤조산(pH 7.0) 농도가 0.02% 이상인 상태로 안락사시키세요.
   참고: 약 34± 15 CFU에 감염된 성체 제브라피시 중 7%, 2029 ± 709 CFU에 감염된 성체 제브라피시 중 30%가 8주까지 증상을 보일 것입니다19. 증상으로는 비정상적인 수영, 촉감에 대한 반응 부족, 헐침, 부종 또는 관찰되는 소모 등이 포함될 수 있습니다.
7. 제브라피시를 일반적인 기준에 따라 관리하세요

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이코박테리움 마리눔	미국 타체 문화 컬렉션	ATCC 927
미들브록 7H10 한천	BD, 써모피셔 사이언티브	11799042
미들브록 OADC 농축	BD, 써모피셔 사이언티브	11718173
미들브록 7H9 미디엄	BD, 써모피셔 사이언티브	11753473
미들브록 ADC 풍부화	BD, 써모피셔 사이언티브	11718173
인산 완충 식염수 정제(PBS)	시그마-올드리치	P4417-50TAB
페놀 레드	시그마-올드리치	P3532
27G 바늘	헨케 사스 울프	4710004020
1 mL 주사기	헨케 사스 울프	4010.200V0
옴니칸 100 30G 인슐린 바늘	브라운	9151133
3-아미노벤조산 에틸 에스터 (pH 7.0)	시그마-올드리치	A5040