조직 생검에서 박테리아 부착을 연구하기 위한 in vitro 평행판 유동 모델

초록

출처: Ditkowski, B. 외 박테리아가 이식 조직에 부착하는 현상을 연구하기 위한 평행판 관류 시스템의 in vitro 모델. J. Vis. 경험 (2019).

이 영상은 평행판 유동 챔버를 이용해 형광 표지된 박테리아를 혈관 이식 조직 위에 관류하는 방법을 시연하여, 전단 흐름 조건에서 박테리아 부착과 초기 병태 기전을 통제하여 분석할 수 있게 합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 심사 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.1. 평행판 유동 챔버를 이용한 시험관 내 관류 실험

1. 직경 10mm, 두께가 같은 조직 생검을 유동 챔버 시스템에 장착하여 내부 표면이 위를 향하게 하여 박테리아 현탁액과 접촉하게 합니다.
   참고: 다양한 이식편에 걸쳐 동일한 조직 두께가 동일하여 채널 내에서 동일한 조직 높이를 유지하여 모든 조건에서 층류 흐름을 가능하게 합니다. 유동 챔버의 모든 요소는 그림 1에 제시되고 설명되어 있습니다.
   1. 프로토콜을 시작하기 위해 원형 조직 조각을 8mm 원형 천공이 있는 현미경 슬라이드와 고무 개스킷 사이에 놓습니다.
      참고: 현미경 슬라이드는 8mm 구멍을 생성할 수 있도록 초박 하단 필름을 가지고 있습니다. 고무 시트와 함께 조직을 고정시켜 시체와 유동 매체 간 직접 접촉을 가능하게 하고, 실험 중 생검의 탈구를 방지합니다. 조사 대상 조직의 표면은 흐름에 노출되어 있어(직경이 작음) 겸자로 조작할 수 없습니다.
      1. 휴지가 든 홀더를 챔버 하단 금속 프레임에 내장된 가스켓 시트에 삽입합니다.
      2. 상단 금속 프레임과 해당 가스켓 시트를 챔버 하단에 미리 삽입한 휴지 홀더를 부착합니다. 그 후 챔버 전체를 8개의 나사와 나사 너트로 장착하세요. 이식편 간 챔버 높이가 항상 같은지 꼭 확인하세요.
         참고: 챔버 높이는 나사를 조일 때마다 항상 결정해야 합니다. 캘리퍼스나 자를 사용하세요.
2. 유동 챔버를 연동 펌프로, 유체 저장소를 튜브로 연결하세요.
3. 조직에 10⁷ CFU/mL(콜로니 형성 단위 계수 및 OD 600(광학 밀도 측정 및 관련 CFU(콜로니 형성 단위) 확인 및 OD₆₀₀(광학 밀도) 측정과 관련된 형광 표지 박테리아를 PBS(인산염 완충 식염수)에서 3 dyne/^{cm 2}(제곱센티미터당 다이네 압력 단위)의 전단 응력으로 1시간 동안 유동 펌프(유량 4 mL)를 사용하여 조직에 400 mL 박테리아 저장소(사내 설계, 그림 1) 플레이트 온도조절기를 사용해 37 °C에서 조절한 상태(재료표).
4. 동일한 수집 저장소를 사용해 100 mL 박테리아 현탁액을 지속적으로 재순환시킵니다.
5. 관류 후 챔버를 분해하여 이식편을 방출하고, 12웰 플레이트에 4mL PBS를 사용해 실험실 오비탈 셰이커를 사용해 각각 3분씩 조직 조각을 세척합니다. 그 후 직경이 작은 피부 생검 펀치로 이식편 내부 부분을 절단했습니다.
6. 각 조직 생검을 1mL 무균 0.9% NaCl이 들어 있는 별도의 14mL 튜브에 삽입합니다. 튜브에 #1이라고 라벨을 붙이세요.
7. 초음파 배스를 사용해 10분간 박테리아를 조직에서 분리합니다(진폭 = 100%, 주파수 = 45 kHz).
   참고: 조직 이식에서 박테리아가 완전히 분리되는지는 패치를 TSB(삼산 대두 육수) 액체 배지에 37°C에서 하룻밤 배양한 후 OD₆₀₀ 측정을 통해 박테리아가 없는 대조군 패치와 비교하여 평가해야 합니다.

결과

그림 1: 새로 개발된 유동 챔버 시스템(자체 설계) 이미지. A. 플로우 챔버 (1) 장착된 플로우 세트는 크기가 LxWxH: 125 mm x 55 mm x 18 mm (나사와 나사 너트가 챔버 부품을 고정하고 금속 프레임 을 통해 가스켓에 압력을 가해 누출을 방지); (2) 기둥의 상부 부분; (3) 튜빙 커넥터를 고정하는 두 개의 구멍이 있는 상단 가스켓 시트로, 이는 유동 챔버와 펌프, 유체 저장소를 튜빙 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 심막(BP) 패치, 유연한 심막 보호막	시노비스 서저리 이노베이션스, 미국	PC-0404SN
소경정맥 관로(BJV)	콘테그라 관로; 메드트로닉, 미국	M333105D001
CH 냉동 보존 동동이식	유럽 동종부록 은행(EHB)	-
아큐-펀치	아쿠덤 주식회사, 미국	P850 (8mm); P1050 (10mm)
인간 알부민	플렉스부민; 백스터, 벨기에	BE171464LOT:16G12C
트립틱 두유 육수 (TSB)	플루카, 슈타인하임, 독일	22092-500G
심장 주입 육수(BHI)	플루카	53286-500G
인산염 완충 식염수(PBS).	깁코	14190-094
5(6)-카복시플루오레세인 N-하이드록시숙신니마이드 에스터 (CF)	시그마-알드리히, 독일	21878-100MG-F
페리스탈틱 펌프 (모델 ISM444B)	이스마텍 BVP-Z 표준; 콜 파머, 베르트하임, 독일	631942-2
초음파 욕조	VWR 초음파 세척기; VWR, 래드너, 펜실베이니아	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong 골드 안티페이드 마운트	ThermoFisher의 인비트로젠	P36930
Arium Pro VF - 초순수 - H2O MilliQ	밀리포어	87206462
현미경 슬라이드 - 조직 배양 챔버 (1-웰)	사르스테트	94.6140.102
루목스 분리형 1-웰	사르스테트	94.6150.101
스테인리스 스틸 - 수술용 칼	스완-모튼	311
타이곤 실리콘 튜빙, 1/8인치 내경 x 1/4인치 외경	콜-파머	EW-95702-06	온도 범위: –80에서 200°C terilize: 에틸렌 옥사이드, 감마 조사 또는 오토클레이브를 30분, 15 psi의 압력으로 사용해
파르메드 BPT 튜빙	생고뱅	AY242012	121°C에서 30분 자동 접기 가능
타이곤 LMT-55 튜빙	생 고뱅 퍼포먼스 플라스틱스™	15312022
온도 조절기	BMG 바이오메디진테크닉	300-0042	230V, 90VA, 50Hz