인산칼슘 형질전환을 이용한 슈도바이러스 패키징 완전 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지(표 1)에서 HEK293FT 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 9 x 10^5개)을 제조한다. 단일 세포 현탁액 10 mL를 T75 플라스크에 넣고, 형질전환 전 37 °C, 5% 이산화탄소(CO2) 배양기에서 20시간 동안 배양한다. 참고: 낮은 계대(20회 미만)의 HEK293FT 세포를 권장한다. 세포 단층의 합쳐짐(confluence) 정도가 80-90%인지 확인한다. 형질전환 2시간 전에 배지를 클로로퀸(100 µM)이 포함된 신선한 완전 배지 10 mL로 교체한다. 표 2와 그림 1에 표시된 대로 시약과 플라스미드 DNA를 혼합한다: ddH2O(이중 증류수), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, 2.5 M CaCl2(염화칼슘) 및 2x 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES) 완충액을 사용한다. 피펫으로 5회 천천히 섞어준 후, 혼합물을 실온(RT)에서 20분 동안 배양한다. 혼합물을 세포 위쪽의 배지에 옮기고 플라스크를 부드럽게 흔들어준다. 세포 배양기에서 세포를 15시간 동안 배양한다. 배지를 신선한 완전 DMEM 배지 15 mL로 교체한다. 37 °C, 5% CO2 배양기에서 세포를 65시간 동안 배양한다. 참고: 배지 색상이 연한 오렌지색 또는 약간 노란색으로 변하며, 도립 광학 현미경 관찰 시 최소 80% 이상의 세포에서 세포병변효과(CPE)가 나타나야 한다. 상층액을 수확하여 4 °C에서 2095 x g로 20분 동안 원심분리한다. 상층액을 수집하여 소분한 후 -80 °C에 보관한다. 표 1: 완전 DMEM 배지 조성. 완전 DMEM 배지 조성 농도 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x 태아 송아지 혈청(Fetal bovine serum) 10% 페니실린(Penicillin)(1 U/mL)/스트렙토마이신(Streptomycin) 1 μg/ mL 표 2: 슈도바이러스 패키징 시스템. 재료 농도 부피 2x HEPES (pH 7.1) -- 675.0 μL CaCl2 (2.5 M) -- 67.5 μL ddH2O -- 529.2 μL pCMV Δ 8.9 1000 ng/μL 18.9 μL pCMV/R-HA 100 ng/μL 27.0 μL pCMV/R-NA 50 ng/μL 13.5 μL pHR-Luc 1000 ng/μL 18.9 μL Chang, X., 등인산칼슘 형질전환법을 이용한 가성형 H5 조류 인플루엔자 바이러스 제작 및 항체 중화 활성 측정. J. Vis. Exp. (2021)
본 영상에서는 인산칼슘 매개 플라스미드 트랜스펙션을 이용한 인간 세포 내 인플루엔자 슈도바이러스(pseudovirus) 생산 과정을 보여줍니다. 이를 통해 생물안전등급 2(biosafety level 2) 조건에서 항체 중화 분석과 같은 후속 응용 단계에 필요한 단일 사이클 바이러스 입자를 안전하게 생성할 수 있습니다.
