감자 식물에서 Potato Virus X 기반의 마이크로RNA 사일런싱

초록

출처: Zhao, J., et al. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato. J. Vis. Exp. (2020).

이 영상에서는 바이러스 기반 microRNA 사이런싱(VbMS)을 위해 Potato Virus X(PVX) 기반의 컨스트럭트를 인비트로(in vitro) 배양된 감자 식물에 전달하는 Agrobacterium tumefaciens의 사용법을 보여줍니다. 이 방법은 표적 microRNA의 전신적 억제를 가능하게 하여, 연구자가 관찰 가능한 표현형 변화를 통해 식물 발달 과정에서 해당 microRNA의 역할을 연구할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 감자 식물에서 PVX 기반 VbMS 분석을 수행합니다.

1. 4주 된 in vitro 감자 식물을 토양에 옮겨 심습니다. 옮겨 심은 식물은 3~4일 후에 VbMS 분석을 수행합니다.
2. PVX-STTM(Short Tandem Target Mimic) 플라스미드를 포함하는 Agrobacterium으로 감자 식물을 접종합니다.
   참고: 감자의 VbMS 분석에서는 Agrobacterium 매개 침투법과 이쑤시개 긁기 접종법을 동시에 수행합니다.
   1. PVX-STTM 벡터를 포함하는 양성 형질전환체를 선택하여 50 μg/mL kanamycin과 50 μg/mL rifampicin이 포함된 50 mL 액체 LB 배지에 접종합니다. 28 °C 배양기에서 220 rpm으로 16시간 동안 OD₆₀₀ = 1.0이 될 때까지 배양합니다.
   2. 동시에, 양성 Agrobacterium 콜로니를 50 μg/mL kanamycin과 50 μg/mL rifampicin이 포함된 최소 두 개의 새로운 LB 플레이트에 도말하고 28 °C에서 1일 동안 배양합니다. 대조군으로 PVX-LIC 벡터를, 바이러스 확산 모니터링용으로 PVX-GFP를 포함합니다.
   3. 실온에서 3,400 x g로 10분 동안 원심분리하여 Agrobacterium 액체 배양액을 수집합니다. 동일한 부피의 침투 버퍼(10 mM MgCl₂, 10 mM MES, 200 µM acetosyringone, pH = 5.6)로 Agrobacterium 세포를 재현탁하고 OD₆₀₀ = 1.0으로 조정합니다. 실온에서 6시간 동안 배양합니다.
   4. 1 mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 Agrobacterium 배양액을 완전히 확장된 잎의 배축면에 침투시킵니다.
      1. 한 손으로 잎을 뒤집어 잡고, 다른 한 손의 손가락 하나로 침투 부위의 잎몸 동축면을 받칩니다. 주사기를 잎 표면에 수직으로 유지하면서 Agrobacterium 배양액을 잎몸의 배축면에 침투시킵니다.
   5. LB 플레이트에서 Agrobacterium 배양액을 긁어내어, 침투시킨 감자 식물의 첫 번째 또는 두 번째 마디 줄기 표면을 이쑤시개로 긁습니다. 줄기의 표피를 부드럽게 긁어냅니다. 식물에 심각한 손상을 줄 수 있으므로 줄기를 관통하지 않도록 주의합니다.
3. 침투시킨 식물을 온실에서 22 °C, 16시간 명기/8시간 암기 광주기, 120 μmol/m²∙ s¹의 광도 조건에서 성장시킵니다.
   참고: miRNA 사일런싱에 의해 유도된 표현형은 보통 접종 후 2~4주 이내에 나타납니다(Figure 1, Figure 2). VbMS 표현형은 일반적으로 침투 후 나타나기까지 10~20일이 소요됩니다. VbMS 표현형은 특정 miRNA 및 표적 유전자의 특성, 성장 조건 및 감자 품종에 따라 달라집니다.

결과

그림 1: 4배체 감자 품종 Katahdin에서의 miR165/166 VbMS. PVX 벡터 대조군 또는 PVX-STTM165/166을 발현하는 감자 식물(Katahdin)의 표현형. 자색 화살표는 잎맥에 이소성으로 생성된 잎 구조를 나타냄. 주황색 화살표 머리는 나팔 모양의 잎 구조를 나타냄. 막대 = 1 cm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agrobacterium tumefaciens 균주: GV3101, GV2260 또는 EHA105.
비료: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed	ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA	G99260
MgCl₂	ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA	MFCD00149781
PVX VIGS 벡터: PVX-LIC
토양: Metro-Mix 360	Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA	Metro-Mix 360
			Zhao et al., 2016