아데노 부속 바이러스(Adeno-Associated Virus)에 대한 망막 투과성 평가를 위한 마우스 망막 동결 절편 제작

초록

출처: Vacca, O., et al. 질환 상태의 망막 장벽 연구 도구로서 아데노 부속 바이러스의 활용. J. Vis. Exp. (2015)

이 영상은 손상된 망막 장벽을 통한 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus)의 투과성을 시각화하기 위한 마우스 망막 동결 절편 제작의 단계별 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플을 포함하는 모든 절차는 해당 동물 윤리 심의 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다. 

1. 망막 동결절편 제작을 위해 (Figure 1), 적출된 안구에서 수정체와 각막을 제거하도록 해부하고, 4% paraformaldehyde에 1 hr 동안 침전 고정한다.
   1. 고정된 안구를 실온에서 10% sucrose로 1 hr, 이어서 20% sucrose로 1 hr 동안 동결 보호한다. 30% sucrose 용액에서 4 °C로 overnight 동안 동결 보호한다. Cryo-matrix와 같은 매립 수지에 안구를 동결 매립한다. 10 µm 두께로 동결 절편을 만들고, 염색 중 조직 부착력을 높여주는 동결 조직 전용 슬라이드에 부착한다.
   2. pH 7.4의 phosphate-buffered saline (PBS)에 0.1% Triton X-100을 넣어 5 min 동안 절편을 투과화한다. PBS로 2회 세척하고, 1% bovine serum albumin (BSA)과 0.1% Tween 20이 포함된 PBS에서 실온으로 1 hr 동안 블로킹한다.

결과

그림 1: 일반 프로토콜의 모식도. 아데노 부속 바이러스(AAV) 제작 후, 마취된 성체 마우스의 유리체 또는 음경 정맥에 입자를 주입합니다. Micron III 카메라를 이용해 안저 영상을 촬영하여 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 추적합니다. GFP 발현 패턴은 면역 조직 화학 염색과 공초점 영상을 통해 망막 냉동 절편 및 평면 도말 망막에서 분석합니다. 유리체 내 또는 복강 내로 주입한 마우스의 혈액 샘플을 대상으로 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석을 실시하여 GFP 서열의 존재 여부를 확인함으로써 혈액-망막 장벽(BRB)을 통과한 AAV를 평가하며, 이는 혈류 내 AAV 입자의 존재를 나타내는 지표가 됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006
Superfrost plus adhesion slides	Thermo Scientific	10143352
Binocular magnifier SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0.66 x 5 x LEDs, 스탠드 epi 및 dia 포함 / 망막 박리
Spring scissors straight - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	망막 박리