동물 샘플을 이용한 모든 절차는 해당 동물 윤리 심의 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다. 1. 면역조직화학염색 망막 평면 표본(그림 1)의 경우, 박리를 용이하게 하기 위해 적출된 안구를 4% 파라포름알데히드에 15분간 고정합니다. 15~30분 후, 안구를 박리하여 각막과 수정체를 제거합니다. 톱니모양선(ora serrata)과 시신경 주변을 절개하여 망막을 망막색소상피(RPE) 및 공막으로부터 분리합니다. 망막과 형질전환된 망막 세포 내 형광 단백질을 고정하기 위해 4% 파라포름알데히드에 30분간 더 침전시킵니다(고정 시간은 24시간을 초과해서는 안 됩니다). pH 7.4의 멸균 PBS로 5분간 세척합니다. 인산완충식염수(PBS)를 블로킹 버퍼(1% 소혈청알부민(BSA), 2% 정상 염소 또는 당나귀 혈청, 0.5% Triton X-100이 포함된 PBS)로 교체하고, 상온에서 4시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 블로킹 버퍼에 배양합니다. 블로킹 버퍼 내의 1차 항체와 함께 조직을 상온에서 4시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척합니다. 참고: 사용된 항체는 다음과 같습니다: 내경계막(ILM)을 표지하는 anti-laminin (1/1,000), 간상을 표지하는 anti-rhodopsin clone 4D2 (1/500), 뮬러 세포를 표지하는 anti-glutamine synthetase clone GS-6 (1/1,500), 원추세포를 표지하는 Peanut agglutinin (PNA) Lectin (1/40). 블로킹 버퍼 내의 1:500으로 희석된 Alexa Fluor 접합 2차 항체와 함께 조직을 빛이 차단된 상온에서 1시간(냉동 절편) 또는 2시간(평면 표본) 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척합니다. 망막에 릴리빙 컷(relieving cuts)을 가하고, 광수용체 또는 망막 신경절 세포(RGC) 층이 위를 향하도록 하여 유리 슬라이드 위에 평면으로 고정합니다. 수성 봉입제를 추가하고 커버슬립을 덮은 후 4 °C에서 보관합니다. 레이저 주사 공초점 현미경으로 공초점 현미경 관찰을 수행합니다. 들뜸 및 방출 크로스토크(crosstalk)를 줄이기 위해 이미지를 라인 단위로 순차적으로 획득합니다. 나이퀴스트-섀넌 샘플링 정리에 따라 스텝 크기를 정의합니다. 최종 이미지에서 과포화된 픽셀을 최소화하는 노출 설정을 사용합니다. FIJI로 12비트 이미지를 처리하고, Z-project 기능을 사용하여 최대 강도로 Z-섹션을 단일 평면에 투영한 후, 최종적으로 8비트 RGB 컬러 모드로 변환합니다. Vacca, O., 외 등질환 상태의 망막 장벽 연구 도구로서 아데노 부속 바이러스의 활용. J. Vis. Exp. (2015).
이 영상에서는 형질전환 생쥐 망막에 AAV를 이용한 유전자 전달 방법과, 이후 내경계막의 무결성을 평가하기 위한 조직 절제 및 염색 과정을 보여줍니다.
