리포터 단백질을 인코딩하는 재조합 HBV(B형 간염 바이러스)의 생산 HepG2 세포 준비 세포 배양 배지를 준비한다(10% fetal bovine serum (FBS), 10 U/ml 페니실린, 10 µg/ml 스트렙토마이신 및 10 U/ml 비필수 아미노산이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)). 형질전환 전날, 10cm 콜라겐 코팅 디쉬에 10ml의 배양 배지와 함께 4 x 106개의 HepG2(Human Hepatocellular Carcinoma G2) 세포를 분주한다. HepG2 세포를 습윤한 5% CO2 인큐베이터 내 37 °C에서 배양한다. 참고: 10cm 콜라겐 코팅 디쉬에 10ml의 배양 배지로 약 4 x 106개의 HepG2 세포를 분주하면 다음 날 70-90%의 합류도(confluency)에 도달한다. 형질전환 제조사의 지침에 따라 형질전환 시약을 사용하여 HepG2 세포에 5 µg의 pUC1.2HBV delta epsilon15(epsilon 서열이 결손된 HBV 복제 플라스미드)와 5 µg의 pUC1.2HBV/NL15를 형질전환한다. 다음 날, 배양 배지를 제거하고 10ml의 신선한 배양 배지를 추가한다. 형질전환 일주일 후, 재조합 HBV가 포함된 배양 배지를 50ml 튜브로 옮기고 단계 1.3으로 진행한다. 형질전환된 세포가 포함된 플레이트에 10ml의 신선한 배양 배지를 추가한다. 참고: 재조합 HBV 생산은 4주 동안 유지된다. 재조합 HBV가 포함된 배양 배지는 4 °C에서 1개월 동안 보관할 수 있다. 재조합 HBV의 정제 원심분리(2,30 x g, 5분)를 통해 재조합 HBV가 포함된 배양 배지에서 세포 잔해를 제거한다. 상층액을 0.45 µm 멤브레인 필터로 여과한다. 재조합 HBV가 포함된 배양 배지에 동일한 부피의 26% PEG/1.5 M NaCl(polyethylene glycol 60 130 g, NaCl (sodium chloride) 49 g, 0.5 M EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) pH 8.0 1 ml 및 1 M HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) pH 7.6 5 ml를 50 ml에 혼합)을 첨가하고 부드럽게 섞는다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다. 4 °C에서 2,300 x g로 20분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 펠렛을 0.5 ml의 TNE(10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 녹인다. 2,30 x g에서 5분 동안 원심분리하여 잔해를 제거한다. 재조합 HBV가 포함된 TNE 0.5 ml를 TNE 내 20% sucrose 0.8 ml 위에 적재한다. 15 °C에서 10,00 × g로 3시간 동안 원심분리한다. 상층액을 가능한 한 많이 제거하고 펠렛을 회수한다. 초기 배양 배지 40 ml당 1 ml의 serum free DMEM에 펠렛을 재현탁한다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다. 0.45 µm 필터로 여과한다. 0.5 ml씩 소분하여 -80 °C에 보관한다. 참고: 원래의 바이러스 샘플에서 리포터 단백질 오염이 관찰되는 경우, TNE 내 5-30% sucrose를 이용한 10,0 x g, 2시간 밀도 구배 초원심분리 또는 1.1-1.6 g/ml 범위의 CsCl(cesium chloride) 밀도 평형 원심분리를 150,00 x g에서 50시간 동안 수행하여 바이러스를 정제한다. Nishitsuji, H., 외 등 복제 주기 초기 단계 모니터링을 위한 B형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발. J. Vis. Exp. (2017)
이 영상에서는 리콤비넌트 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus) 입자의 생산 및 정제 방법을 보여줍니다. 이를 통해 초기 감염 사건 연구 및 고속 대량 항바이러스제 스크리닝 응용 분야를 위한 안전하고 복제 능력이 결여된 바이러스 제제를 준비할 수 있습니다.
