TEM 시료 준비 TEM용으로 설계된 탄소 지지막(니켈) 그리드를 준비한다. 참고: 시설 내 현미경 사용 시 권장되는 시약 및 취급 방법에 대해 코어 시설(core facility)과 상의하십시오. 습기 노출을 최소화하기 위해 그리드는 제습제가 들어 있는 상자나 진공 챔버에 보관해야 한다. 여과지를 약 5 cm x 5 cm 크기로 자른다. 유리 페트리 접시와 현미경 사용에 적합한 셀프 클로징 리버스 핀셋(self-closing reverse tweezers)을 준비한다. 파라핀 필름을 약 2.5 cm x 5 cm 크기로 자른다. 이를 벤치탑 위에 놓는다. 노로바이러스 GII.4 Sydney 캡시드의 열처리 캡시드 형태로 조립된 정제된 인간 노로바이러스 GII.4 Sydney(Accession: JX459908)의 주요 캡시드 단백질(VP1)을 준비한다. 참고: 본 연구의 캡시드는 R. Atmar(Baylor College of Medicine, Houston, TX)로부터 제공받았다. 개별 캡형 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (pH 7.4)를 사용하여 캡시드를 최대 15 µL 부피로 희석한다. 튜브에 최소 60 ng의 캡시드가 포함되어 있는지 확인한다. 처리-리간드 조합당 60 ng의 캡시드가 있도록 한다. 열처리 장치(thermal cycler)를 원하는 열처리 온도로 예열한다. 참고: 본 프로토콜에서는 68 °C에서 다양한 시간(0 ~ 25분) 동안 처리하는 조건을 선택하였다. 즉각적인 냉각을 위해 추가 열처리 장치를 4 °C로 예열한다. 캡시드 용액이 든 튜브를 원하는 시간 동안 열처리 장치에 넣는다. 가열 후 즉시 4 °C로 예냉된 장치로 옮겨 5분간 유지한다. 원심분리기로 짧게 스핀 다운(spin down)하여 모든 액적을 튜브 바닥으로 모은다. 처리된 캡시드 용액 약 15 µL 전체를 파라핀 필름 위에 피펫팅한다. 핀셋으로 그리드 가장자리를 잡아 고정한 후, 처리된 용액 액적 위에 그리드의 탄소막 면이 아래로 가도록 놓는다. 캡시드가 그리드에 부착될 수 있도록 10분 동안 배양한다. 캡시드 조제물의 순도에 따라 필요한 경우, 처리된 캡시드 액적 뒤에 10~15 µL의 10 mM HEPES 용액 액적을 일렬로 배치하여 세척한다. 10분 후, 액적과 함께 그리드를 들어 올린다. 액적을 제거하기 위해 그리드를 여과지에 거의 수직으로 세워 닿게 한다. 10 ~ 15 µL의 HEPES 버퍼 액적을 그리드로 들어 올려 30초 동안 유지한 후, 다른 여과지로 액적을 흡수시켜 세척한다. 파라핀 필름의 빈 공간에 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 용액 15 µL 액적을 놓는다. 그리드로 우라닐 아세테이트 액적을 들어 올려 45초 동안 유지한다. 우라닐 아세테이트를 흡수시키되, 용액의 대부분이 제거되도록 한다. 그리드가 핀셋의 습기에 "들러붙지" 않도록 주의하며, 그리드의 탄소막 면이 위로 오게 하여 여과지 위에 놓는다. 그리드가 놓인 여과지를 개방형 유리 페트리 접시에 넣는다. 참고: 그리드가 정전기적으로 끌려 접시에 달라붙을 수 있으므로 플라스틱 페트리 접시는 사용하지 마십시오. 모든 처리 조건에 대해 위 과정을 반복한다. TEM 관찰 전, 그리드가 담긴 페트리 접시 절반을 데시케이터에 넣어 하룻밤 동안 건조시킨다. 준비된 그리드의 관찰과 관련하여 해당 기관의 현미경 시설에 문의한다. 일부 시설에서는 사용자가 해당 장비의 작동법을 교육받는 것을 허용한다. 특정 현미경의 설정 및 관찰에 관한 세부 사항은 본 논문의 범위를 벗어난다. Moore, M. D., 외. 바이러스 캡시드 구조적 무결성 결정을 위한 대안적 인비트로(In Vitro) 방법. J. Vis. Exp.(2017).
이 비디오에서는 정제된 바이러스 캡시드를 열처리하고 준비하여 투과 전자 현미경(TEM)으로 이미징함으로써 구조적 변화와 열로 인한 손상을 확인하는 방법을 보여줍니다.
