스피로헤타 박테리아의 박테리오파지 매개 유전자 전달

초록

Eggers, C. H. 라이임병 스피로헤타 Borrelia burgdorferi의 파지 매개 유전자 조작. J. Vis. Exp. (202). 이 영상은 카나마이신 내성 플라스미드를 운반하는 폴리에틸렌 글리콜 침전 비감염성 박테리오파지를 이용한 유전자 변형 Borrelia 스피로헤타의 형질전환 과정을 보여줍니다. 박테리아와 함께 배양한 후, 배양액을 항생제가 첨가된 배지에 도말합니다. 플라스미드를 전달받은 세포만이 생존하여 콜로니를 형성합니다. 이후 이 콜로니들을 선택하여 항생제가 포함된 액체 배지에서 증식시킴으로써, 후속 응용 연구를 위해 플라스미드를 보유한 안정적인 박테리아 집단을 구축합니다. Eggers, C. H. 파지 매개 라임병 스피로헤타의 유전적 조작 Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp.. (2022).

이 영상에서는 카나마이신 내성 플라스미드를 운반하며 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킨 비감염성 박테리오파지를 사용하여 유전적으로 변형된 Borrelia 스피로헤타의 형질전환 과정을 보여줍니다. 박테리아와 함께 배양한 후, 배양물을 항생제가 첨가된 배지에 도말합니다. 플라스미드를 전달받은 세포만이 생존하여 콜로니를 형성합니다. 이후 이 콜로니들을 선택하여 항생제가 포함된 액체 배지에서 증식시킴으로써, 후속 응용 단계에 사용할 수 있는 안정적인 플라스미드 보유 박테리아 집단을 구축합니다.

프로토콜

1.박테리오파지 φBB-1의 PEG(polyethylene glycol) 침전 후 형질도입 분석

1. 형질도입 분석의 수용체로 사용할 B. burgdorferi 배양액을 준비합니다. 결정된 밀도를 바탕으로 15 mL의 1 × 107 spirochetes·mL−1를 얻는 데 필요한 수용체 배양액의 부피를 계산합니다.
2. 해당 부피의 배양액을 6,0 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라내고 펠릿을 14.5 mL의 신선한 BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) 배지에 재현탁합니다.
3. PEG 침전된 파지 샘플을 50 µL 이하로 수용체 클론 배양액에 첨가합니다. 잘 혼합하고 3 °C에서 72-96시간 동안 배양합니다.
   참고: PEG 침전 과정에서 회수되는 파지의 양은 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나 유도된 B. burgdorferi 균주 CA-11.2A의 15 mL 배양액에서 50 µL에는 통상적으로 50-1,0개의 생존 가능한 파지가 포함되어 있습니다. 파지 회수 부피가 50 µL 이상일 경우, SM (Suspension Medium) 대 BSK의 비율 증가로 인해 B. burgdorferi의 성장에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
4. PEG 침전된 파지와 혼합 후 고체 배지 도말을 통해 형질도입체를 선별합니다.

2. 형질도입체의 선택

참고: 잠재적 형질도입체의 고체 배지 도말은 프로토콜의 단층 변형법을 사용하여 수행합니다. B. burgdorferi 콜로니는 한천 내에서 성장하므로, 고체 배지 도말을 통한 형질도입체 선택을 위해서는 플레이트를 부을 때 샘플을 배지에 추가해야 합니다. 이 기술 또한 형질도입체 선택에 효과적일 수 있으나, 아직 이 목적으로 시도된 바는 없습니다.

1. 형질전환체 선별을 위해 도말할 형질도입 시험군 및 대조군의 샘플 수에 근거하여 필요한 플레이트 수를 결정하십시오.
   참고: 일반적으로 샘플당 두 개의 플레이트를 붓는데, 하나는 배양액 부피의 약 10%에 해당하는 양을 붓고 다른 하나에는 나머지 배양액을 모두 붓습니다. 또한, 선택 과정에서 사용된 항생제 존재 하에서 파지 제제 및/또는 공여체와 수용체로 사용된 모클론이 성장하지 않는지 개별적으로 확인하기 위한 음성 대조군 플레이트를 준비합니다. 최소 두 개의 추가 플레이트를 위한 도말 재료를 준비하는 것이 권장됩니다. 예를 들어, 도말할 샘플과 대조군의 수가 8개라면 10개의 플레이트를 만들 수 있는 충분한 양의 도말 혼합물을 준비하십시오.
2. 아래에 설명된 방법에 따라 도말용 용액을 준비하십시오.
   참고: 각 플레이트는 30mL이며, 도말용 1.5x BSK 20mL와 2.1% 아가로스 10mL로 구성됩니다(2:1 비율). 이를 통해 최종 농도가 1x BSK 및 0.7% 아가로스인 플레이트가 만들어집니다. 예를 들어, 10개의 플레이트를 만들려면 1.5x BSK 20mL와 2.1% 아가로스 100mL로 구성된 총 30mL의 도말 혼합물을 준비하십시오.
   1. 1.5x BSK에 나열된 각 성분량을 사용하여 1.5x BSK 1 L를 준비하십시오. 1x BSK와 동일한 방법으로 보관하십시오.
   2. 물에 2.1% 아가로스를 준비하여 오토클레이브한다. 아가로스 용액은 즉시 사용하거나 실온에서 보관한다. 실온에서 보관한 경우, 플레이팅 전 뚜껑을 느슨하게 닫은 상태에서 완전히 녹을 때까지 전자레인지로 가열한다.
   3. 전체 도말 혼합액을 기준으로 적절한 농도를 맞추기 위해 필요한 항생제의 부피를 결정하십시오.
      참고: 최종 도말 용액의 총 부피가 30 mL인 경우, 1.5x BSK 20 mL와 30 mL 전체에 대해 정확한 최종 항생제 농도가 되도록 충분한 양의 항생제를 혼합하십시오. 도입 시험(transduction assay)의 공여균과 수용균이 서로 다른 항생제 내성 유전자를 가지고 있다면, 도말 혼합액에는 두 가지 항생제가 모두 포함되어야 합니다. 공여균에서 PEG로 침전시킨 파지가 항생제 내성 마커를 인코딩하고 수용균에는 내성 마커가 없다면, 도말 혼합액에는 한 가지 항생제만 포함되어야 합니다.
3. 분주할 플레이트 수에 따라, 전체 플레이팅 혼합물을 담기에 충분한 크기의 멸균 병에 적절한 양의 1.5x BSK와 항생제를 옮깁니다. 다음 온도의 항온수조에서 평형을 맞춥니다. 56 °C 15분 이상 동안.
4. 오토클레이브 또는 전자레인지에서 가열하여 녹인 아가로스를 다음의 용기에서 평형화하십시오. 56 °C 항온수조에서 15분 이상 가열.
5. 평형 도달 후, 1.5x BSK(항생제 포함)가 담긴 병에 정해진 양의 2.1% 아가로스를 첨가하고, 플레이팅 용액을 다시 항온수에 넣습니다. 42 °C 10-15분 동안.
   참고: 높은 온도는 스피로헤타를 손상시키거나 사멸시킬 수 있습니다36. 위에서 사용한 것과 동일한 항온수조를 사용하는 경우, 항온수조의 온도를 42-45 °C 평형화 타이머를 시작하기 전에. 도말 용액을 다음 온도에서 평형화하지 마십시오. 42 °C 20분 이상 방치하지 마십시오. 그렇지 않으면 플레이트를 부을 때 응고되기 시작합니다.
6. 평형 도달 시간 동안, 다음을 준비하십시오. B. burgdorferi 도말할 샘플. 도말할 양을 멸균된 50 mL 원추형 원심분리관으로 옮깁니다.
7. 1.5 mL 미만의 양을 도말하는 경우 (<(최종 플레이트 부피 30 mL의 5%), 시료를 새 튜브로 옮기고 플레이팅 과정 중에 플레이팅 믹스를 시료에 직접 첨가하십시오.
   1. 더 큰 부피의 경우에는, 원하는 부피의 배양액을 새 튜브로 옮긴 후 실온에서 6,00 x g로 10분 동안 원심분리하십시오. 10-500 µL 상층액의 일부를 보관하고, 나머지 상층액을 사용하여 플레이팅 전 펠렛을 완전히 재현탁하십시오.
   2. 공동 배양 후 대조군 플레이트를 위해, 공여균 또는 수용균 클론 $\ge 10^7$개의 세포를 멸균된 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브에 넣습니다. 부피가 1.5 mL를 초과하는 경우, 원심분리 후 펠릿을 재현탁합니다. PEG-침전 파지를 사용하여 형질도입 분석을 수행한 경우, 수용균 클론과 더불어 10-250 µL 도말을 위해 멸균된 50 mL 원심 분리관에 파지 샘플을 분취합니다.
8. 도말 용액이 42-45 °C 10-15분 동안 대기한 후, 도말 용액 30 mL를 해당 샘플이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 즉시 도말 혼합물과 샘플을 라벨이 부착된 플레이트에 분주하십시오. 도말할 각 샘플마다 새로운 피펫을 사용하여 이 과정을 반복합니다.
9. 플레이트를 15~20분 동안 굳힌 다음, 다음 장소에 넣으십시오. 33 °C 5% CO2가 공급되는 배양기₂플레이트를 부은 후 최소 48시간 동안은 뒤집지 마십시오.
10. 수용 클론의 배경에 따라, 10~21일간 배양 후 선택 플레이트의 아가로스 내에 콜로니가 나타나는지 확인하십시오. 멸균된 면마개 처리된 5.75인치 붕규산 유리 피펫을 사용하여 두 가지 항생제가 모두 포함된 플레이트에서 성장한 콜로니를 최소 5~10개 선택하고, 이를 적절한 항생제가 포함된 1.5mL의 1x BSK에 접종하십시오.
11. 접종된 콜로니를 다음 조건에서 배양하십시오. 33 °C 3-5일 동안 또는 암시야 현미경의 20배 배율에서 한 시야당 약 20-40마리의 스피로헤타 밀도에 도달할 때까지 배양합니다.
    참고: 스크리닝이 완료된 스피로헤타는 −에서 장기 보관을 위해 냉동할 수 있습니다.80 °C 동일한 부피의 배양액을 여과 멸균된 60% 글리세롤과 40% 1x BSK 혼합액과 섞어 0.22 µm 필터

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 원추형 원심분리 튜브 (폴리프로필렌)	USA Scientific	5618-8271
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	주의: 잠재적 발암물질; 반드시 화학 흄 후드 내에서 사용ir
5.75 파스퇴르 피펫 (면 마개/붕규산 유리/비멸균)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	사용 전 오토클레이브 멸균
50 mL 원추형 원심분리 튜브 (폴리프로필렌)	USA Scientific	150-1211
절대 에탄올
Erythromycin	Research Products International Corp	E5700-25.0
Gentamicin 시약 용액	Gibco	15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)	Thermo Fisher Scientific	BP350-50
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-50
Kanamycin sulfate	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0