오가노이드의 렌티바이러스 형질전환 0일차: 형질전환 2일 전에 0.95 cm² 웰 전체의 오가노이드를 새로운 웰로 분할하여 약 50개의 작은 오가노이드를 얻습니다. 오가노이드를 분할합니다 (그림 1A, B). 낭성 과증식 움(cystic hyperproliferative crypts)을 얻기 위해 오가노이드 배양액에 10 µM Chir99021과 10 mM 니코틴아마이드(nicotinamide)를 첨가합니다 (그림 1C). 참고: 갓 분할한 오가노이드를 Chir99021 존재 하에 배양할 때 낭성 움이 가장 잘 발달합니다. 2일차: p1000 마이크로피펫으로 Matrigel과 배양액을 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 분쇄함으로써 오가노이드를 회수합니다. 혼합물을 15 mL 튜브에 옮깁니다. 열 가공으로 끝부분의 개구부를 좁힌 파스퇴르 피펫을 사용하여 추가로 분쇄합니다. 오가노이드를 100 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet)화합니다. 참고: 원심분리기의 크기에 따라 원심분리 속도를 다르게 조절하십시오. 분쇄된 오가노이드가 혼합물로부터 분리되는 정확한 속도를 찾는 것이 중요합니다. 상층액을 제거하고 미리 데워둔 1x 트립신(0.25% 트립신과 유사) 500 µL를 첨가합니다. 오가노이드를 트립신에 재현탁하고 37 °C 항온수조에서 3분 동안 배양합니다. 세포주 배양액[10% fetal calf serum (FCS), 1% penicillin/streptomycin 및 glutamine이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)] 3.5 mL를 첨가하여 트립신을 불활성화합니다. 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하여 약 20 µL의 배양액 내에 펠렛만 남깁니다. 이 소량의 배양액과 함께 오가노이드를 48-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 형질전환 배양액에 고역가 렌티바이러스를 첨가하고 재현탁한 후 단계 3.10으로 진행합니다. 형질전환 효율이 낮을 때 적용하십시오. 참고: 효율적인 형질전환을 위해서는 일반적으로 오가노이드가 담긴 한 개의 웰에 250 µL의 고역가 렌티바이러스 한 알리쿼트(aliquot)를 첨가합니다. 이는 단일 생산분에서 회수된 전체 렌티바이러스의 50%에 해당합니다. 선택 사항: 형질전환 효율을 높이려면, 오가노이드가 포함된 48-웰 플레이트를 32 °C로 미리 데워진 원심분리기에 넣고 600 x g에서 1시간 동안 회전시키는 스피노큘레이션(spinoculation)을 수행합니다. 오가노이드-바이러스 혼합물을 배양 인큐베이터에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 형질전환이 일어나게 합니다. 선택 사항: 형질전환 효율을 더욱 높이려면, 배양 인큐베이터의 37 °C에서 오가노이드를 3시간 더 배양합니다. 오가노이드 배양액 1 mL를 첨가하여 오가노이드-바이러스 혼합물을 재현탁하고, 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 850 x g에서 5분 동안 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 얼음처럼 차가운 Matrigel 20 µL에 재현탁합니다. 재료가 따뜻해지면 응고되므로, 차가운 PBS를 여러 번 위아래로 피펫팅하여 냉각시킨 피펫 팁을 사용하십시오. 방울을 48-웰 플레이트 웰의 중앙에 떨어뜨리고 37 °C 배양 인큐베이터에서 15분 동안 배양하여 응고시킵니다. 15분 후, 10 mM 니코틴아마이드, 10 µM Chir99021 및 10 µM Y27632가 첨가된 오가노이드 배양액 250 µL를 조심스럽게 첨가합니다. 분쇄된 작은 오가노이드 파편들은 24시간 이내에 작은 낭성 오가노이드로 형성됩니다. 5일차: 배양액을 교체하고 선택 항생제를 첨가합니다(puromycin의 경우 4 µg/mL 사용). 7일차: 배양액을 선택 항생제가 첨가된 표준 오가노이드 배양액으로 교체합니다. 참고: Chir99021 제거 후 2~3주 후에 출아(budding)가 완료됩니다. 선택 과정 이후에는 선택 항생제 없이 오가노이드를 배양할 수 있습니다. Van Lidth de Jeude, J. F., 외 등 장 오가노이드의 렌티바이러스 형질전환 및 후속 분석 프로토콜. J. Vis. Exp. (2015)
이 비디오에서는 은하형 구조(crypt-like structure) 함유 현탁액으로부터 마우스 장 오가노이드를 렌티바이러스로 형질전환하는 과정을 설명합니다. 기저막 매트릭스를 지지체로 사용하고 성장 인자가 첨가된 배지를 이용하여, 안정적인 유전자 통합이 가능하도록 렌티바이러스 벡터를 도입합니다.
