이중 아데노바이러스 형질도입을 이용한 SMAD 경로 활성화 검출

초록

생존 단일 세포 내 이중 아데노바이러스 형질전환 12-웰 플레이트의 각 웰에 5% 태아 송아지 혈청(FBS)이 포함된 500 μL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배양 배지를 사용하여 MDA-MB-231 세포를 1.0 - 1.5 x 105개씩 분주한다(세포 합쳐짐 정도 35%, 총 2개 웰). 100% 감염 양성률을 달성할 수 있도록 75 μL의 아데노바이러스 벡터 Ad-CMV-GFP(역가 = 5 x 109 PFU/mL)와 7.5 μL의 아데노바이러스 벡터 Ad-CAGA12-Td-Tom(역가 = 5 x 1010 PFU/mL)을 세포에 감염시켜 감염 다중도(MOI)를 2,500으로 맞춘다. 아데노바이러스 감염 직후, 웰당 0.25 μL의 Transforming Growth Factor-beta (TGF-β)(스톡 농도 10 mg/mL, 최종 농도 5 ng/μL)를 처리하거나 처리하지 않는다. 플레이트를 37 °C, 10% CO2 조건의 인큐베이터에 24시간 동안 배양한다. 위상차 형광 현미경으로 생존 세포를 촬영한다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 470 nm에서, Td-Tomato 단백질은 554 nm에서 여기시킨다. Chen, H., 등. TGF-β의 살아있는 세포 이미징β아데노바이러스 리포터 시스템을 이용한 Smad3 신호 전달 경로의 인비트로 및 인비보 분석. J. Vis. Exp. (2018).

이 영상에서는 이중 아데노바이러스 감염을 이용하여 유방암 세포 내 SMAD 경로 활성화를 연구하는 방법을 보여줍니다. 하나의 바이러스는 상시 발현되는 GFP 유전자를 전달하며, 다른 하나는 SMAD 민감성 프로모터 하위의 RFP 리포터를 운반합니다. TGF-beta 자극 시 SMAD 단백질이 활성화되어 복합체를 형성하고, 이는 RFP 발현을 유도합니다. 살아있는 세포에서 이중 신호가 검출되면 경로가 활성화된 것으로 확인됩니다.

프로토콜

1. 살아있는 단일 세포 내 이중 아데노바이러스 형질전환

1. 12-well 플레이트의 각 웰에 5% fetal bovine serum (FBS)가 포함된 500 μL의 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 배양액과 함께 1.0 - 1.5 x 10⁵ MDA-MB-231 세포를 분주합니다 (세포 밀도 35%, 총 2개 웰).
2. 75 μL의 아데노바이러스 벡터 Ad-CMV-GFP (titer = 5 x 10⁹ PFU/mL)와 7.5 μL의 아데노바이러스 벡터 Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 10¹⁰ PFU/mL)을 세포에 감염시켜 2,500의 감염 다중도 (MOI)를 확보하며, 이를 통해 100%의 감염 양성률을 달성할 수 있습니다.
3. 아데노바이러스 감염 직후, 웰당 0.25 μL의 transforming growth factor-beta (TGF-β)를 처리하거나 처리하지 않습니다 (스톡 농도 10 mg/mL, 최종 농도 5 ng/μL).
4. 플레이트를 37 °C, 10% CO₂ 조건의 인큐베이터에 24시간 동안 보관합니다.
5. 위상차 형광 현미경으로 살아있는 세포를 촬영합니다. green fluorescent protein (GFP)는 470 nm에서, Td-Tomato 단백질은 554 nm에서 여기시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	ThermoFisher	1881024	사용 전 37 °C 항온수조에서 가온
Foetal Bovine Serum	Scientifix Life	FBS500-S	사용 전 열 불활성화
Recombinant Human TGF-β1	PEPROTECH	100-21	DDW로 분주하여 최종 농도를 10 mg/mL로 제조
위상차 형광 현미경	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
용액			조성
FBS-DMEM			5% 열 불활성화 FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin