감염된 인간 림프구 내 바이러스 핵산 및 단백질의 다중 형광 이미징

초록

1. 단백질 면역염색: 관심 단백질 표지를 위해 PBS(인산 완충 식염수)를 따라내고, 커버스립에 200 µL의 블로킹 버퍼(0.1% v/v Tween-20가 포함된 PBS(PBST) 내 1% w/v BSA(소 혈청 알부민), 10% v/v FBS(소 태아 혈청))를 첨가한다. 실온(RT)에서 1시간 동안 배양한다. 블로킹 버퍼를 따라내고 PBST + 1% w/v BSA에 희석한 1차 항체 200 µL를 처리한다. 실온에서 1시간 동안 배양한다. 슬라이드를 PBST로 실온에서 흔들어주며 10분 동안 2회 세척한다. 선택한 2차 항체를 PBST + 1% w/v BSA 내에서 실온으로 1시간 동안 처리한다. 슬라이드를 PBST로 실온에서 흔들어주며 10분 동안 세척한다. 2. 핵 염색: 면역염색 후 핵을 대조 염색한다. PBST를 따라내고 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 또는 선택한 핵 염색제를 실온에서 1분 동안 처리한다. 슬라이드를 PBS로 실온에서 흔들어주며 10분 동안 2회 세척한다. Shah, R., 등바이러스 핵산 및 단백질 시각화와 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염 모니터링을 위한 단일 세포 다중 형광 이미징. J. Vis. Exp. (2020)

이 영상에서는 분지형 DNA 하이브리다이제이션과 면역형광법을 사용하여 감염된 인간 림프구 내의 HIV-1 DNA, RNA 및 캡시드 단백질을 동시에 시각화함으로써, 개별 세포 내에서 바이러스 복제 단계에 대한 상세한 분석이 가능함을 보여줍니다.

프로토콜

1. 단백질 면역염색: 표적 단백질 표지

1. PBS (phosphate-buffered saline)를 따라내고 0.1% v/v Tween-20이 포함된 PBS(PBST) 내 1% w/v BSA (bovine serum albumin), 10% v/v FBS (fetal bovine serum)로 구성된 블로킹 버퍼 200 µL를 커버슬립에 추가한다. RT (room temperature)에서 1시간 동안 배양한다.
2. 블로킹 버퍼를 따라내고 PBST + 1% w/v BSA에 희석한 1차 항체 200 µL를 처리한다. RT에서 1시간 동안 배양한다.
3. 슬라이드를 PBST로 RT에서 10분 동안 흔들어주며 2회 세척한다.
4. PBST + 1% w/v BSA 내에서 선택한 2차 항체를 RT에서 1시간 동안 처리한다.
5. 슬라이드를 PBST로 RT에서 10분 동안 흔들어주며 세척한다.

2. 핵 염색: 면역 염색 후 핵 대조 염색

1. PBST를 따라내고 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 또는 선택한 핵 염색약을 처리하여 RT에서 1분 동안 반응시킨다.
2. 슬라이드를 PBS로 RT에서 10분 동안 흔들어주며 2회 세척한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-HCV NS5a 항체	Abcam	ab13833	마우스 단클론 항체; HCV 유전자형 1a, 1b, 3 및 4에 적용 가능
Anti-HIV-1 p24 단클론 항체	NIH AIDS 시약 프로그램	3537
Anti-Mov10 항체	Abcam	ab80613	토끼 다클론성
소혈청알부민			면역염색용 블로킹 시약
첨가제가 포함된 세포 배지			세포 모델에 적합한 배지
커버슬립
DAPI	ACD Bio		핵 염색 (ACD Bio의 RNAscope 키트)
Dulbecco's 인산완충생리식염수 (1X PBS)	Gibco	14190250	칼슘 및 마그네슘 없음
소태아혈청 (FBS)			이차 항체가 생성된 혈청 종류(예: 염소 FBS)에 따라 그에 맞는 특정 FBS를 사용하십시오.
Fisherbrand colorfrost plus 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	사전 세척된
슬라이드
Tween-20			DNA 하이브리다이제이션 완충액 및 PBS-T의 경우