크기 배제 크로마토그래피를 이용한 프로토타입 포미 바이러스 인타좀의 정제

초록

1. 인타좀 가용화 새 면도날이나 메스 날을 사용하여 깨끗한 표면에서 200 µL 팁의 끝부분 2-4 mm를 제거하여 와이드 보어 피펫 팁 2개를 준비한다. 참고: 이 팁들은 단계 1.3과 1.5에서 사용된다. 투석 버퍼에서 투석 튜브를 꺼낸다. 클립 근처의 튜브 끝에 남아 있을 수 있는 투석 버퍼로 인해 인타좀 샘플이 희석되는 것을 방지하기 위해, 소형 피펫 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 과잉의 투석 버퍼를 제거한다. 투석 튜브의 한쪽 끝에서 클립을 제거한다. 단계 1.1에서 준비한 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 투석 튜브 내부의 침전물을 포함한 샘플을 얼음 위의 1.5-mL 튜브로 옮긴다. 참고: 회수된 물질의 총 부피는 일반적으로 약 140 µL이다. 침전물이 포함된 샘플은 200 mM NaCl 상태이다. 적절한 부피의 5 M NaCl 스톡 용액을 첨가하여 최종 농도를 320 mM NaCl로 높인다. 예를 들어, 150 µL 샘플의 경우, 5 M NaCl 3.9 µL와 ddH2O 1.1 µL를 첨가하여 최종 부피를 155 µL로 맞춘다. 샘플이 담긴 아이스 버킷을 4 ˚C 저온실로 옮긴다. 단계 1.1에서 준비한 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 피펫팅으로 침전물을 재현탁 및 가용화한다. 최소 1시간 동안 20분마다 반복한다. 대부분의 침전물이 용해되는지 확인한다. 참고: 시간 경과에 따라 침전물이 더 이상 눈에 띄게 감소하지 않는 것이 명백해지면 재현탁을 위한 피펫팅을 중단할 수 있다. 바이러스 DNA(vDNA)가 표지되지 않았거나 내부 표지된 경우, 육안 검사 시 침전물이 약 90% 감소한다. Cy5 말단 표지 vDNA의 경우, 침전물은 약 20%만 감소하며, 형광체 말단 표지 vDNA가 포함된 침전물의 대부분은 가용화되지 않는다. 효과적으로 가용화되는 침전물의 양은 가변적이므로 실험적으로 결정해야 한다. 2. 인타좀 정제 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 운용 버퍼(20 mM Bis-tris propane, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% glycerol) 250 mL를 준비한다. 버퍼를 0.2-µm 필터 유닛으로 멸균 여과하여 4 ˚C에 보관한다. 참고: 모든 정제 단계는 4 ˚C 저온실에서 수행된다. 가교 아가로스 SEC 컬럼(직경 = 10 mm; 길이 = 300 mm; 베드 부피 = 24 mL; 샘플 부피 = 25 - 500 µL; 최대 압력 = 1.5 MPa; 분획 한계 = 4 x 10^7 Da; 5 ~ 5,000 kDa 사이의 분자량 분리, 재료 표 참조)을 0.4 mL/min의 유속으로 SEC 운용 버퍼를 사용하여 평형화한다. 참고: Superose 12 10/300 GL 또는 Superose 6 Increase와 같이 300 kDa와 44 kDa를 효과적으로 분리할 수 있는 다른 크기 배제 컬럼에 맞게 이 정제 과정을 조정할 수 있다. Superose 12 10/300 GL은 해상도가 낮아 피크의 중첩이 더 많이 발생한다. 반면, Superose 6 Increase는 해상도가 더 높아 더 우수한 분리 능력을 제공한다. 인타좀 샘플을 마이크로원심분리기에서 4 ˚C, 14,000 x g로 10분 동안 원심분리하여 남은 침전물을 펠릿화한다. 상층액을 조심스럽게 제거한다. 상층액을 200 µL 주입 루프(약 200 μL를 유지할 수 있는 튜브)에 로딩한다. 샘플을 SEC 컬럼에 적용한다. 참고: 로딩 부피가 작을수록 SEC 해상도가 높아진다. 25 mL의 SEC 운용 버퍼로 용출시키고 270 µL씩 95개 분획을 수집한다. SEC 크로마토그램에 세 개의 A280/A260 피크가 나타나는지 확인한다(그림 1). 참고: 첫 번째 피크는 응집체(~9.0 - 11.5 mL 용출)여야 하며, 이어서 PFV 사량체 인타좀 피크(~12.0 - 14.75 mL 용출), 그리고 유리 vDNA를 포함한 PFV IN 단량체 피크(~15.0 - 18.0 mL)가 나타나야 한다. Mackler, R. M., 외 등프로토타입 포미 바이러스 인타좀의 조립 및 정제. J. Vis. Exp. (2018)

이 영상에서는 염 추출 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질-DNA 혼합 현탁액으로부터 prototype foamy virus (PFV) intasome을 정제하여, 후속 분석에 사용할 수 있는 활성 복합체를 얻는 과정을 보여줍니다.

프로토콜

1. 인타좀(Intasome) 가용화

1. 깨끗한 표면에서 새 면도날이나 메스를 사용하여 200 µL 팁 끝부분의 2-4 mm를 제거하여 와이드 보어(wide bore) 피펫 팁 2개를 준비합니다.
   참고: 이 팁들은 1.3단계와 1.5단계에서 사용됩니다.
2. 투석 튜브를 투석 완충액에서 꺼냅니다. 클립 근처의 튜브 끝에 남아 있을 수 있는 투석 완충액으로 인해 인타좀(intasome) 샘플이 희석되는 것을 방지하기 위해, 작은 피펫 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 과잉 투석 완충액을 제거합니다. 투석 튜브의 한쪽 끝에서 클립을 제거합니다.
3. 1.1단계에서 준비한 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 투석 튜브 내부의 침전물을 포함한 샘플을 얼음에 박아둔 1.5-mL 튜브로 옮깁니다. 
   참고: 회수된 물질의 총 부피는 일반적으로 ~140 µL입니다.
4. 침전물이 포함된 샘플은 200 mM NaCl 농도입니다. 적절한 부피의 5 M NaCl 스탁 용액을 첨가하여 염 농도를 최종 320 mM NaCl로 높입니다. 예를 들어, 샘플 부피가 150 µL인 경우, 3.9 µL의 5 M NaCl과 1.1 µL의 ddH₂O를 첨가하여 최종 부피를 155 µL로 만듭니다. 샘플이 담긴 아이스 버킷을 4 ˚C 저온실로 옮깁니다.
5. 1.1단계의 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 피펫팅으로 침전물을 재현탁 및 가용화합니다. 이를 최소 1시간 동안 20분마다 반복합니다. 대부분의 침전물이 용해되는지 확인합니다.
   참고: 시간 경과에 따라 침전물이 더 이상 눈에 띄게 감소하지 않는 것이 분명해지면 재현탁을 위한 피펫팅을 중단할 수 있습니다. 바이러스 DNA(vDNA)가 표지되지 않았거나 내부 표지된 경우, 육안 검사 결과 침전물이 ~90% 감소합니다. Cy5 말단 표지 vDNA의 경우, 침전물은 ~20%만 감소하며, 형광체 말단 표지 vDNA가 포함된 침전물의 대부분은 가용화되지 않습니다. 효과적으로 가용화되는 침전물의 양은 가변적이므로 실험적으로 결정해야 합니다.

2. 인타좀 정제

1. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 러닝 버퍼(20 mM Bis-tris propane, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% glycerol) 250 mL를 준비한다. 0.2-µm 필터 유닛으로 버퍼를 멸균 여과하여 4 ˚C에 보관한다.
   참고: 모든 정제 단계는 4 ˚C 저온실에서 수행한다.
2. 교차 결합 아가로스 SEC 컬럼(직경 = 10 mm; 길이 = 300 mm; 베드 부피 = 24 mL; 시료 부피 = 25 - 500 µL; 최대 압력 = 1.5 MPa; 배제 한계 = 4 x 10⁷ Da; 5 및 5,000 kDa 사이의 분자량 분리, 재료 표 참조)을 0.4 mL/min의 유속으로 SEC 러닝 버퍼를 이용해 평형화한다.
   참고: 300 kDa와 44 kDa를 효과적으로 분리할 수 있는 경우, Superose 12 10/300 GL 또는 Superose 6 Increase와 같은 다른 크기 배제 컬럼으로 변경하여 정제할 수 있다. Superose 12 10/300 GL은 해상도가 낮아 피크의 중첩이 더 많이 발생한다. 반대로, Superose 6 Increase는 해상도가 더 높아 더 우수한 분리 능력을 제공한다.
3. 인트라좀(intasome) 시료를 마이크로 원심분리기에서 4 ˚C, 14,000 x g로 10분 동안 원심분리하여 남아 있는 침전물을 펠렛화한다. 상층액을 조심스럽게 제거한다. 상층액을 200 µL 인젝션 루프(~200 μL를 수용할 수 있는 튜빙)에 로딩한다. 시료를 SEC 컬럼에 주입한다.
   참고: 로딩 부피가 작을수록 SEC에 의한 해상도가 높아진다.
4. 25 mL의 SEC 러닝 버퍼로 용출시키고 270 µL씩 95개의 분획을 수집한다. SEC 크로마토그램에 세 개의 A₂₈₀/A₂₆₀ 피크가 나타나는지 확인한다 (그림 1).
   참고: 첫 번째는 응집체(~9.0 - 11.5 mL 용출)여야 하며, 이어서 PFV tetramer 인트라좀 피크(~12.0 - 14.75 mL 용출)와 유리 vDNA가 포함된 PFV IN monomer 피크(~15.0 - 18.0 mL)가 나타나야 한다.

결과

그림 1: 크기 배제 크로마토그램. PFV 인타좀(intasome) 복합체를 아가로스 SEC 컬럼으로 분리하였다. 이 컬럼을 통해 응집체(1), PFV IN 사량체와 두 개의 vDNA로 구성된 PFV 인타좀(2), 그리고 단량체 PFV IN 및 vDNA(3)를 분리할 수 있다. 본 예시에는 650 nm 여기(excitation)로 검출되는 내부 Cy5 형광 표지 vDNA가 포함되었다. y축은 밀리 흡광 단위(mAU)의 광밀도(OD)를 나타낸다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DNA 올리고머	IDT	N/A	주문 제작 DNA 올리고
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propane, >=99.0% (적정)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
글리세롤	Thermo Fisher Scientific	G37-20
겔 로딩 팁, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
면도날; 단면; 100개/팩	Fisher Scientific	12-640
투석 튜브 클립	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm 투석 튜브	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201