RT-qPCR(실시간 정량 중합효소 연쇄 반응)을 위한 바이러스 시료 처리 참고: 단계 1.1~1.3은 생물안전작업대 내에서 수행해야 합니다. 특히, 감염성 바이러스가 포함된 배양 상청액의 취급은 생물안전등급 2(또는 그 이상) 환경에서 이루어져야 합니다. 1. 처리 완충액 199 μL와 뉴클레아제 프리 proteinase K 1 μL를 혼합합니다. 2. 40 units/mL RNase 억제제가 포함된 세포 배양 배지(예: 10% 태아 송아지 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM [DMEM/10% fetal bovine serum])를 사용하여, 합성된 DENV(뎅기 바이러스) 3'UTR(비번역 지역) RNA(리보핵산)를 1:10으로 연속 희석하여 5 x 10⁹에서 5 x 10³ copies/μL 농도의 RNA 표준물을 준비합니다. 3. 8튜브 PCR 스트립 또는 96-well PCR 플레이트를 사용하여, DENV 감염 세포의 배양 상청액 5 μL 및 DENV 3'UTR RNA 표준물을 처리 완충액/proteinase K 용액 5 μL와 혼합합니다. 템플릿 무첨가 대조군(NTC)으로는 세포 배양 배지(즉, 바이러스 미포함) 5 μL를 처리 완충액/proteinase K 용액 5 μL와 혼합합니다. 4. 짧게 원심 분리한 후, 열 순환기에서 다음 조건으로 시료를 배양합니다: 1 사이클(25 °C에서 10분, 75 °C에서 5분). 참고: 실시간 PCR 분석을 당일에 수행하는 경우, 처리된 시료는 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 장기 보관 시에는 시료를 -80 °C에 보관해야 합니다. Suzuki, Y., 외 등실시간 정량 중합효소 연쇄 반응을 이용한 감염 세포 배양 상등액 내 뎅기 바이러스 RNA 측정. J. Vis. Exp. (2018).
이 영상에서는 정량 PCR(Polymerase chain reaction) 분석을 위한 바이러스 시료 준비 절차를 보여줍니다. 바이러스 시료와 RNA 표준물을 단계별로 희석하고, proteinase K 완충액으로 처리한 후, 제어된 온도에서 배양하여 RNA를 유리시킵니다. 처리된 RNA는 이후 안정화되어 바이러스 RNA 수준의 정량을 위해 보관됩니다.
