인간 간암 세포로부터의 E형 간염 바이러스 입자 수확

초록

출처: Meister, T. L., et al. 고역가 E형 간염 바이러스 스톡 생산을 위한 세포 배양 모델. J. Vis. Exp. (2020).

이 영상은 형질전환된 인간 간세포암 세포에서 E형 간염 바이러스(HEV) 입자를 분리하는 과정을 보여줍니다. 세포 외 바이러스 입자는 여과된 상층액에서 수집하며, 세포 내 입자는 세포를 반복적인 동결-해동 주기에 노출시켜 방출시킵니다. 용해물을 원심분리한 후, HEV 입자가 포함된 상층액을 소분하여 향후 사용을 위해 초저온에서 보관합니다

프로토콜

1. 세포 배양 유래 HEV (HEVcc) 생산을 위한 HepG2 세포 준비
참고: 오염을 방지하기 위해 세포 준비, 전기천공법, 감염, 수확 및 세포 고정은 생물안전 2등급(BSL-2) 시설의 무균 상태에서 수행되었습니다. 세포가 포함된 37 °C 배양 단계는 5% CO₂ 배양기에서 이루어졌습니다.

1. HEVcc 생산을 위해 HepG2 세포를 준비하려면 (그림 1), 완전 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ( 표 1 참조)에서 세포를 15 cm 콜라겐 (표 1 참조, 콜라겐을 추가하기 전 0.2 µm 메쉬를 통해 멸균 여과된 인산완충생리식염수 (PBS)-아세트산 혼합액을 사용) 코팅 배양 접시에 파종합니다. 세포가 90% 합쳐질 때까지 37 °C에서 배양합니다.
   참고: 90% 합쳐진 세포가 포함된 15 cm 접시 하나당 최대 4회의 전기천공에 필요한 충분한 세포를 생성할 수 있습니다.
2. 플레이트에서 배지를 조심스럽게 제거하고 10 mL의 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세포에 3 mL의 0.05% trypsin-EDTA를 추가하여 트립신 처리하고, 세포가 완전히 떨어질 때까지 37 °C에서 배양합니다. 세포를 10 mL DMEM 완전 배지에 재현탁하고 세포 현탁액을 50 mL 튜브로 옮깁니다. 총 세포 수를 결정합니다.
3. 각 전기천공마다 5 x 10⁶ 세포가 필요하므로, 적절한 부피를 새 50 mL 튜브로 옮기고 1x PBS를 사용하여 최소 35 mL까지 채웁니다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심 분리하고 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
4. 35 mL의 1x PBS로 200 x g에서 5분 동안 세포를 다시 한 번 세척합니다. 세포를 현탁 상태로 유지하기 위해 1x PBS를 아직 제거하지 않은 상태로 세포를 얼음에 둡니다.

2. HepG2 세포의 전기천공법

1. HepG2 세포의 전기천공법(그림 2)을 위해, 384 µL의 Cytomix( 표 1 참조)에 2 mM ATP와 5 mM Glutathione을 첨가하여 전기천공법 1회당 40 µL의 Cytomix complete를 준비합니다. 사용 직전에 신선하게 준비하여 즉시 얼음에 둡니다.
   참고: 다음 단계들을 정확하고 빠르게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 따라서 모든 준비가 적절히 완료되었는지 확인하십시오.
2. 4.4단계에서 형성된 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 1x PBS를 조심스럽게 제거합니다. 5 x 10⁶ 개의 세포를 40 µL의 Cytomix complete에 재현탁하고 5 µg RNA를 첨가합니다. 용액을 4 mm 큐벳으로 옮기고 전기천공 시스템을 사용하여 975 µF, 270 V에서 20 ms 동안 1회 펄스를 줍니다.
   1. 전기천공 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 전기천공 1회당 1 mL의 complete DMEM으로 최대한 빠르게 옮깁니다.
      참고: RNA가 HepG2 세포로 성공적으로 형질전환되었는지 확인하기 위해 형질전환 대조군(TC) 실험을 수행합니다. 예상 형질전환 효율은 ORF2 양성 세포의 40-60% 사이입니다.
3. 전기천공된 세포 10 mL를 콜라겐이 코팅된 10 cm 배양 접시에 옮깁니다. 커버슬립이 포함된 콜라겐 코팅 24-마이크로타이터 플레이트의 한 웰에 전기천공된 세포 1.3 x 10⁵ 개(30 µL)를 넣습니다(이후 형질전환 대조군으로 사용됨). 세포를 균일하게 분산시키고 37 °C에서 배양합니다.
   1. 24시간 후, 10 cm 접시의 배지를 제거하고 10 mL의 신선한 complete DMEM으로 교체합니다. 형질전환 대조군의 배지는 교체하지 않습니다. 37 °C에서 6일 더 배양합니다.

3. 세포 배양 유래 세포 내 및 세포 외 HEV (HEVcc) 수확

1. 세포 외 HEVcc를 수확하려면(그림 3), 6일 후 10 cm 디시에서 얻은 상층액을 0.45 µm 메쉬로 여과하여 세포 잔해를 제거하십시오. 수확한 세포 외 HEVcc는 당일 감염시킬 경우 4 °C에 보관하고, 그렇지 않으면 -80 °C에 보관하십시오.
2. 세포 내 HEVcc를 수확하려면(그림 3), 1x PBS로 세포를 세척하고 0.05% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (trypsin-EDTA) 1.5 mL를 첨가하여 트립신 처리하십시오. 세포가 완전히 떨어져 나올 때까지 37 °C에서 배양합니다. complete DMEM 10 mL를 첨가하고 플레이트를 헹궈 세포를 분리한 후, 세포 현탁액을 50 mL 튜브로 옮깁니다. PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 20 x g에서 5분 동안 원심 분리합니다.
   1. 상층액을 버리고 전기천공 1회당 1.6 mL의 complete DMEM에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 2 mL 반응 튜브로 옮깁니다.
      참고: 더 많은 부피를 사용하면 바이러스 역가가 급격히 감소하므로 주의하십시오.
   2. 세포를 동결(액체 질소 이용) 및 해동합니다. 이 과정을 3회 반복합니다.
      참고: 용해 효율이 떨어질 수 있으므로 3회의 동결-해동 사이클 동안 전기천공 1회분(1.6 mL) 이상의 양을 합치지 마십시오. 사이클 사이에 세포 현탁액을 볼텍싱하지 마십시오. 바이러스 역가를 최대화하기 위해 세포 현탁액을 천천히(예: 실온 또는 얼음 위에서) 해동하십시오.
   3. 용해된 세포를 10,0 x g에서 10분 동안 고속 원심 분리하여 세포 잔해를 분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 해당 상층액을 감염에 사용하거나, 그렇지 않으면 -80 °C에 보관하십시오.
   4. 선택적으로, 농축기를 사용하여 세포 외 및 세포 내 HEVcc를 농축함으로써 바이러스 역가를 높일 수 있습니다.

표 1: 완충액 조성표.

작업 용액	농도	부피
Collagen	40 mL	PBS
	40 µl	Acetic acid
	1 mL	Collagen R solution 0.4% sterile
Cytomix	120 mM	KCl
	0.15 mM	CaCl2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7.4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
DMEM complete	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (10X)
	5 mL	L-Glutamin
	50 mL	Fetal bovine serum
MEM complete	50 mL	MEM
	5 mL	Sodium pyruvate
	5 mL	Gentamycin
	5 mL	MEM NEAA (10X)
	5 mL	L-Glutamine
	50 mL	ultra-low IgG

결과

그림 1: 세포 배양 기반 HEV (HEVcc) 생산을 위한 HepG2 세포 준비의 모식도.

그림 2: HepG2 세포의 전기천공법을 위한 모식도적 실험 설정.

그림 3: 세포 내 및 세포 외 HEVcc 수확을 위한 모식적 실험 설정.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	세포 외 바이러스 수확
MEM	gibco	31095-029	세포 배양
MEM NEAA (10×)	gibco	140-035	세포 배양
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	154054	세포 배양
ultra-low IgG	gibco	192105PJ	세포 배양
Acetic acid	CarlRoth	675.1	콜라겐 작업 용액
ATP	Roche	1140965001	인비트로 전사 및 전기 천공법
BioRender	BioRender		그림 생성
Calcium chloride	Roth	5239.2	Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	콜라겐 작업 용액
DMEM	gibco	41965-039	세포 배양
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	165260	전기 천공법
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Di-potassium hydrogen phosphate	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Potassium di-hydrogen phosphate	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	세포 배양
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	세포 배양
MEM NEAA (10×)	gibco	1140-035	세포 배양
Magnesium chloride	Roth	2189.2	Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA 농도 측정
PBS	gibco	701051	세포 배양
Pen/Strep	Thermo Fisher	1514012	세포 배양