유정란 요막액으로부터의 바이러스 정제

초록

출처: Yates, J. G. E., 외. 요막액으로부터 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 바이러스에 감염된 유정란에서 수집하여 정제한 요막액으로부터 바이러스 입자를 정제하고 농축하는 과정을 보여줍니다. 여기에는 온전한 바이러스를 분리하기 위한 뎁스 필터레이션(depth filtration), 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 및 밀도 구배 초원심분리를 포함한 일련의 여과 및 분리 단계가 제시됩니다. 이후 바이러스가 풍부한 분획물을 투석하여 잔류 염과 구배 성분을 확산으로 제거하고, 고장액을 이용한 삼투 현상을 통해 농축합니다. 그 결과, 실험에 적합한 정제된 고역가 바이러스 조제물이 얻어집니다. Yates, J. G. E., 외 등 요막액으로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스 생산. J. Vis. Exp. (2022)

본 영상에서는 바이러스에 감염된 유정란에서 수집하여 정제한 요막액으로부터 바이러스 입자를 정제하고 농축하는 과정을 보여줍니다. 온전한 바이러스를 분리하기 위해 depth filtration, 접선 흐름 여과(tangential flow filtration) 및 밀도 구배 초원심분리를 포함한 일련의 여과 및 분리 단계를 제시합니다. 이후 바이러스가 풍부한 분획을 투석하여 확산을 통해 잔류 염과 구배 성분을 제거하고, 고장액을 이용한 삼투 현상으로 농축합니다. 그 결과, 실험에 적합한 정제된 고역가 바이러스 제제가 준비됩니다.

프로토콜

1. 특정 병원체 부재(SPF) 유정란을 이용한 뉴캐슬병 바이러스(NDV)의 증폭

1. 특정 병원균 부재(SPF) 유정란 접종
   참고: 통상적으로 1회분의 in vivo 등급 뉴캐슬병 바이러스(NDV) 배치를 생산하기 위해 8다스(96개)의 SPF 유정란을 사용합니다. 운송 중 파손 및 생존율의 변동성을 고려하여 1~2다스의 여분의 달걀을 추가로 주문하십시오.
   1. SPF 수발생 유정란을 수령한 후, 다음과 같은 조건의 부화기에서 배양하십시오. 37 °C, 습도 60%에서 9일간 배양한다. 인큐베이터가 매시간 자동으로 달걀을 흔들거나 회전시키도록 설정되었는지 확인한다.
      참고: 난은 실온에서 최대 24시간 동안 보관하거나 4 °C 최대 72시간까지 가능하나, 이는 배아의 생존율을 감소시킬 수 있습니다.
   2. 8~11일간의 배양 후(가급적 9일째에), 검란을 통해 배아의 생존 여부를 확인합니다. 거미줄 모양의 혈관 구조를 확인하십시오.그림 1A) 및 배아의 움직임을 생존 배아의 지표로 간주하십시오. 이러한 특징이 없는 계란은 폐기하십시오(그림 1B).
   3. 생존한 계란의 기낭과 배아 사이의 경계면에 연필로 'X' 표시를 합니다.그림 1A). 이 주입 부위가 혈관 천공을 일으키지 않도록 주의하십시오. 접종액을 준비하는 동안 표시된 계란들을 배양기로 다시 옮기십시오.
   4. 모든 SPF 유정란에 접종하는 데 필요한 바이러스의 양을 계산하십시오. 각 달걀에 100 plaque-forming unit(PFU)의 바이러스가 다음 부피로 투입되도록 하십시오. 100 µL; 인산완충생리식염수(PBS)로 바이러스를 1 농도로 희석합니다. × 10³ PFU/mL. 바이러스 투여 시 발생할 수 있는 오차를 고려하여 접종액을 20% 추가로 준비하십시오.
   5. 정전기 방지 와이프를 사용하여, 70% 에탄올에 희석한 10% 요오드 용액으로 표시된 계란의 윗부분을 닦아냅니다. 용액이 마를 때까지 약 1~2분 동안 기다립니다.
   6. 멸균된 날카로운 핀셋을 사용하여 껍질을 조심스럽게 뚫습니다. 달걀 하나를 처리할 때마다 핀셋을 70% 에탄올로 소독하십시오.
   7. 1 mL 주사기와 25 G 바늘을 사용하여, 주입하십시오. 100 µL 단계 1.1.4에서 준비한 접종물을 장액낭강(chorioallantoic cavity)으로그림 1C). 바늘을 거의 __도 각도로 접근하여 90° 달걀에 각도를 맞춰 바늘을 융모allantois막(chorioallantoic membrane)의 상단에 살짝 삽입하십시오.
   8. 접종 후 매니큐어를 사용하여 천공 부위를 밀봉하고 달걀을 배양기로 되돌려 놓습니다. 접종 후 24시간까지는 로킹(rocking) 설정이 켜져 있는지 확인하십시오.
   9. 접종 24시간 후 계란의 생존력을 확인하십시오. 장액성 난막(chorioallantoic membrane)에 혈관이 없고 배아의 움직임이 없는 폐사란은 폐기하십시오.그림 1B).
      참고: 이 알들은 NDV가 아니라 접종 과정으로 인해 폐사한 것입니다.
   10. 난각막의 단백질이 요막액으로 유입되어 오염되는 것을 방지하기 위해, 로커(rocker) 설정을 끈 상태에서 달걀을 배양기에 다시 넣으십시오.
   11. 단계 1.1.9에 설명된 대로 12~24시간마다 달걀을 확인하여 폐사한 달걀을 식별하십시오. 접종 후 24시간 이후에 폐사한 달걀은 다음으로 이동시키십시오. 4°C 자가분해를 최소화하십시오. 냉각 후 2~12시간 이내에 요막액을 수확하십시오.
   12. 알을 최소 72시간 동안 배양하십시오.
       참고: 중간병원성(mesogenic) NDV 균주를 증식시키는 경우, 최적 배양 시간은 60~72시간입니다. 배양 시간이 길어지면 요막액의 투명도가 떨어져 정제 과정에 지장을 줄 수 있기 때문입니다. 저병원성(lentogenic) NDV 균주의 경우 배아를 사멸시키는 데 훨씬 더 오랜 시간이 걸리므로, 이러한 문제는 그리 중요하지 않습니다.
   13. 적절한 배양 기간이 지난 후, 남은 계란을 다음으로 이동시키십시오. 4 °C 요막액을 수확하기 전 2-12시간 동안 유지합니다.
2. NDV 함유 요막액 수확
   1. 냉장 보관된 계란을 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮깁니다. 70% 에탄올로 계란의 윗부분을 닦아냅니다.
   2. 멸균 집게와 외과용 가위를 사용하여 기낭이 위치한 달걀의 정단부를 절개하여 엽니다.
   3. 껍질을 제거하여 요막낭(chorioallantoic membrane)을 노출시킵니다 (그림 1D).
   4. 막을 조심스럽게 뚫고 뒤로 젖혀 요막강을 노출시킵니다 (그림 1E). 난황낭이 실수로 천자되지 않도록 주의하십시오. 난황낭이 손상되면 달걀을 사용할 수 없게 됩니다.
   5. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 배아를 잡고 배아낭을 엽니다.
      참고: 배아낭 내부의 액체에도 NDV가 포함되어 있습니다.
   6. 포셉으로 배아를 누르고 10 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 요막액을 수집합니다.
   7. 정제 전까지 요막액을 15mL 원추형 튜브에 담아 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 요막액의 색이 노란색인 경우, 난황낭이 손상된 것이므로 해당 요막액은 폐기해야 합니다.
   8. 요막액이 담긴 원뿔형 튜브를 1,500에서 원심분리하십시오. × 분 동안 [숫자]g로 원심분리하여 4 °C.
   9. 일시 중단 지점: 정제된 요막액을 50 mL 원추형 튜브에 소분하여 - 온도에서 보관하십시오.80 °C 장기간 보관(예: 수주에서 수개월) 시에는 동결-해동의 가혹한 영향으로부터 바이러스를 보호하기 위해 액체에 sucrose를 추가하여 최종 농도를 5%로 맞춥니다. 또는 단기간 보관(예: 1~3일) 시에는 allantoic fluid에 sucrose(최종 5%) 또는 3× 최종 농도가 1이 되도록 Mannitol-Lysine (ML) 완충액(15% Mannitol, 3% Lysine)을 첨가한다.× (5% 만니톨, 1% 라이신)을 첨가하여 다음 온도에서 보관하기 전 단계 4 °C.

2. 요막액으로부터 NDV 정제

1. 요막액의 depth filtration
   1. 정제된 요막액을 -80 °C에 보관하고 정제 전날 밤 4 °C에서 해동한다.
   2. 생물안전작업대 내에서 그림 2에 표시된 대로 튜빙과 연동 펌프를 설치한다.
   3. 아직 수행하지 않았다면, 요막액을 3× ML 버퍼와 혼합하여 최종 농도를 1×로 맞춘다.
   4. depth 필터를 장착하기 전, 0.5 M 수산화나트륨(NaOH) 50 mL를 시스템을 통해 폐액 용기로 통과시켜 튜빙을 멸균한다.
   5. 멸균된 분자생물학 등급의 물 100 mL를 시스템을 통해 폐액 용기로 통과시켜 튜빙을 헹군다.
      참고: NaOH는 NDV를 불활성화시키므로, 바이러스가 포함된 요막액을 주입하기 전에 라인을 충분히 세척하는 것이 중요하다.
   6. PBS 50 mL를 시스템에 흘려 프라이밍하며, 튜브에 PBS가 약 5 mL 남았을 때 펌프를 정지시킨다.
   7. 1-3 µM 정격 유지력을 가진 depth 필터를 튜빙에 장착하고, 필터 상단의 두 번째 캡을 제거하여 필터를 통기시킨다. 시스템에 PBS 50 mL를 추가로 흘리기 시작한다.
   8. PBS가 필터 상단의 통기구를 통해 흐르기 시작하면 포트를 닫고 라인에 PBS를 계속 흘린다.
      참고: 약간의 기포는 허용되지만, 많은 양의 공기가 있으면 단계 2.1.7 및 2.1.8에 설명된 대로 필터를 다시 통기시켜야 한다.
   9. 튜브에 PBS가 약 5 mL 남았을 때 펌프를 정지시킨다.
   10. 폐액 용기를 새 멸균 수집 용기로 교체하고 depth 필터를 통해 요막액을 흘리기 시작한다.
       참고: 압력이 10 psi를 초과하면 바이러스의 전단 응력이 발생하므로 주의해야 한다. 압력은 펌프의 유량을 줄이거나 늘려서 조절할 수 있다. 압력이 10 psi를 초과하기 시작하고 유량을 더 이상 줄일 수 없는 경우, 새 depth 필터를 사용해야 한다. 이 경우 요막액의 흐름을 재개하기 전 단계 2.1.6-2.1.8을 수행해야 한다.
   11. 모든 요막액이 필터를 통과하면, 바이러스 회수율을 극대화하기 위해 1× ML 버퍼 50 mL를 라인에 흘린다.
   12. 라인이 마를 때까지 액체를 수집한다. 바이러스를 4 °C에서 하룻밤 또는 최대 36시간 동안 보관한다.
       참고: 바이러스를 depth-filtered 한 후에는 depth filtration 완료 후 36시간 이내에 정제 과정을 계속 진행한다.
   13. depth 필터를 분리하고, 42 °C로 예열된 0.5 M NaOH 및 400 ppm 표백제를 100 mL 흘려 튜빙을 살균한 후 0.5 M NaOH에 보관한다.
2. NDV 농축을 위한 접선 유동 여과(TFF)
   1. 생물안전작업대에서 그림 3A에 묘사된 대로 카세트 구성 요소를 조립한다.
      참고: 매니폴드와 엔드플레이트는 사용 전 세제로 세척하고 건조해야 한다. 실리콘 가스켓은 재사용 가능하며 카세트와 함께 0.5 M NaOH에 보관해야 한다.
   2. 접선 유동 여과(TFF)(또는 cross-flow filtration) 시스템을 '개방' 구성(그림 3B)으로 설정한다.
      1. 카세트를 처음 사용하는 경우, TFF 카세트를 Elution 구성으로 조립하고 멸균된 분자생물학 등급의 물 100 mL로 플러싱한다(그림 3C).
      2. 저장 탱크에 물이 5 mL만 남았을 때 펌프를 일시 정지하고 TFF 시스템 설정을 폐쇄 구성(그림 3D)으로 변경한다.
      3. 저장조에 42 °C로 예열된 0.5 M NaOH 및 400 ppm 표백제 100 mL를 추가하고 30-60분 동안 시스템을 순환시킨다.
      4. 흐름을 일시 정지하고 TFF 시스템을 elution 설정으로 되돌린 후, 흐름을 재개하여 세척액을 용출시킨다.
      5. 저장조에 약 5 mL가 남았을 때 펌프를 일시 정지하고 멸균된 분자생물학 등급의 물 100 mL를 추가하여 시스템을 헹군다.
      6. 저장조에 약 5 mL가 남았을 때 펌프를 일시 정지하고 TFF 시스템을 개방 구성(그림 3B)으로 둔다. 단계 2.2.3으로 계속 진행한다.
   3. 연동 펌프를 사용하여 0.5 M NaOH 100 mL를 시스템에 통과시켜 카세트와 튜빙을 멸균한다. 카세트의 무결성을 유지하기 위해 압력이 30 psi를 초과하지 않도록 한다.
   4. 저장조에 0.5 M NaOH가 약 5 mL 남았을 때 펌프를 일시 정지한다.
   5. 저장조에 멸균된 분자생물학 등급의 물 100 mL를 추가하고 유체를 카세트에 계속 통과시킨다. 바이러스의 불활성화를 방지하기 위해 저장조 벽면의 모든 NaOH를 씻어내도록 저장조를 돌려준다. 저장조 세척 단계를 반복한다.
   6. 저장조에 멸균된 분자생물학 등급의 물이 약 5 mL 남았을 때 펌프를 일시 정지한다.
   7. 저장조에 PBS 100 mL를 추가하고, 돌려주어 멸균된 분자생물학 등급의 물이 벽면에서 씻겨 나가도록 한다. 카세트를 통한 액체 흐름을 재개한다.
   8. 저장조에 약 5 mL가 남았을 때 펌프를 일시 정지하고, depth-filtered 된 요막액을 저장조에 추가한 후 펌프 흐름을 재개한다.
   9. 바이러스의 전단 응력을 방지하기 위해 압력계 1(그림 3B)을 모니터링하여 10 psi를 초과하지 않도록 한다. 연동 펌프의 속도와 C-클램프를 조합하여 폐액으로의 용출을 증가시킨다.
      참고: 연동 펌프의 속도와 C-클램프를 함께 사용하면 압력이 증가한다.
   10. 저장조에 요막액이 50-100 mL 남았을 때, 펌프를 일시 정지하고 1× ML 버퍼 150-200 mL를 추가하여 버퍼 교환을 수행한다.
   11. 펌프 흐름을 재개하며, 다시 압력계 1(그림 3B)을 모니터링하여 10 psi를 초과하지 않도록 한다.
   12. 저장조에 5-10 mL가 남았을 때 펌프를 일시 정지한다.
   13. 그림 3C에 표시된 대로 두 개의 C-클램프를 사용하여 두 개의 폐액 라인을 닫는다.
   14. 저장조로 들어가는 retentate 라인을 분리하여 50 mL conical tube에 삽입한다(그림 3C).
   15. 펌프의 흐름을 재개하고, 저장조 탱크에 액체가 몇 방울 남았을 때 일시 정지한다.
   16. 폐액 라인에서 C-클램프를 제거하고 retentate 공급 라인을 저장조 탱크에 다시 연결한다(그림 3B).
   17. 1× ML 버퍼 20-25 mL를 추가하고 저장조 탱크에 약 5 mL가 남을 때까지 펌프 흐름을 재개한다.
   18. 단계 2.2.13에서 2.2.16을 반복한다.
       참고: 바이러스 수율을 높이기 위해 단계 2.2.17 및 2.2.13-2.2.16을 반복하여 3차 용출을 수행할 수 있다. 하지만 대부분의 바이러스는 처음 두 번의 용출물에 존재한다.
   19. 용출을 마친 후 바이러스를 얼음 위나 4 °C에 둔다.
   20. 라인을 세척하려면, 그림 3D에 묘사된 대로 폐액 라인이 저장조로 다시 들어가는 폐쇄 루프 형식(그림 3D)으로 시스템을 설정한다.
   21. 42 °C로 예열된 0.5 M NaOH 및 400 ppm 표백제 250 mL를 추가하여 시스템을 세척한다.
   22. 세척액을 하룻밤 동안 시스템에 흘린다.
       참고: 세척액을 재순환시키는 동안 펌프를 50 mL/min의 속도로 가동하면 약 5 psi의 압력이 관찰되어야 한다. 압력이 이를 초과하면 카세트가 오염된 것이므로 세척액을 교체하고 과정을 반복해야 한다.
   23. 두 폐액 라인과 retentate 라인을 모두 폐액 용기로 유도하여 세척액을 용출시킨다.
   24. 저장조에 멸균수 400-500 mL를 추가하고 이를 시스템을 통해 폐액 용기로 흘린다.
   25. 저장조에 약 5 mL가 남았을 때 펌프를 일시 정지하고, 저장조 탱크에 0.5 M NaOH 100-200 mL를 추가한 후 용액을 돌려 저장조 용기를 세척한다.
   26. 저장조가 거의 비면 단계 2.2.23을 두 번 더 반복한다.
   27. TFF 설정을 분해하고, TFF 카세트와 가스켓을 소량의 0.5 M NaOH에 넣어 밀봉 가능한 플라스틱 백에 담아 4 °C에 보관한다.
       참고: 튜빙은 0.5 M NaOH에 담근 채 실온에서 보관할 수 있다.
3. Iodixanol 밀도 구배 초원심분리
   1. 초원심분리기를 켜고 4 °C로 예냉 설정한다. 사용할 로터 역시 4 °C로 예냉한다(재료 표 참조).
      참고: 로터는 4 °C에 보관해야 한다.
   2. 스톡 60% iodixanol 용액(구매 당시 농도)을 PBS 및 3× ML 버퍼로 희석하여, ML 버퍼의 최종 농도가 1×가 되도록 40%, 20%, 10% iodixanol 용액을 제조한다.
   3. 13.2 mL 오픈 탑 박막 초원심분리 튜브에 40%, 20%, 10% iodixanol 용액을 각각 0.5 mL, 2.5 mL, 2.5 mL씩 층층이 쌓는다(그림 4A).
      참고: 초원심분리 튜브를 옆으로 기울여 용액을 천천히 배출하면 두 구배 층이 섞일 위험을 크게 줄일 수 있다. 각 층의 분리가 뚜렷해야 하며, 구배의 각 층 사이에 "헤일로(halo)"가 보여야 한다.
   4. 마커 펜을 사용하여 다양한 구배 층의 인터페이스를 표시한다.
   5. TFF 과정에서 용출된 바이러스 6-6.5 mL를 밀도 구배 위에 층으로 쌓는다. 밀도 구배가 흐트러지지 않도록 단계 2.3.3에 설명된 대로 바이러스를 조심스럽게 추가한다.
   6. 오픈 탑 저울을 사용하여 인서트 간의 무게 차이를 0.01 g 이내로 맞춰 스윙 버킷 로터용 인서트에 초원심분리 튜브를 장착한다(재료 표 참조). 무게 차이를 맞추기 위해 PBS나 추가 바이러스 용출액을 사용한다.
   7. 튜브의 균형이 맞으면 캡을 닫고 로터에 장착한다.
   8. 4 °C에서 125,000 × g로 1.5시간 동안 원심분리한다.
      참고: 지연 시작 기능이 있는 초원심분리기를 사용하는 경우 하룻밤 동안 수행할 수 있다.
   9. 초원심분리 후 멸균 핀셋을 사용하여 튜브를 제거한다. 10%와 20% 구배 사이의 타겟 밴드(큰 밴드)를 확인한다(그림 4B).
   10. 레토르트 스탠드를 사용하여 비커 상단에 튜브를 고정한다.
   11. 18 G × 1.5인치 바늘을 5 mL 주사기에 장착하고 초원심분리 튜브의 측면을 찌른다.
       참고: 튜브는 타겟 밴드보다 약간 아래를 찔러야 하며, 바늘을 위쪽 각도로, 베벨(bevel)이 위를 향하게 하여 타겟 밴드로 진입하도록 해야 한다.
   12. 플런저를 천천히 밀어 타겟 밴드를 제거한다.
       참고: 추출되는 바이러스를 최대화하기 위해 바늘을 타겟 밴드 내에서 움직인다. 다른 밴드나 부스러기가 타겟 밴드와 섞이지 않도록 주의하고, 용액을 너무 많이 취하지 않도록 한다(그렇지 않으면 더 많은 투석 카세트를 사용하게 된다).
   13. 타겟 밴드를 추출한 후 바늘을 제거하고 남은 용액을 폐액 비커로 배출한다. 모든 초원심분리 튜브에서 모든 밴드가 추출될 때까지 타겟 밴드를 50 mL conical tube에 분주한다.
   14. 모든 초원심분리 튜브에서 모든 타겟 밴드가 추출될 때까지 단계 2.3.10-2.3.13을 반복한다.
   15. 단계 2.3.10에서 2.3.13에 설명된 타겟 밴드 추출의 대체 방법
       1. 피펫을 사용하여 타겟 밴드 위에 얹혀 있는 액체를 천천히 제거한다. 타겟 밴드에 도달하면 피펫으로 추출하여 바이러스를 50 mL conical tube에 보관한다.
          참고: 이 방법을 사용하면 초원심분리 튜브를 재사용할 수 있다.
4. 바이러스 용액에서 iodixanol 제거
   참고: NDV가 포함된 밴드는 15%에서 16% 사이의 iodixanol 밀도에서 나타난다. 용액 내 iodixanol 농도는 표준 곡선을 참조하여 340 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정할 수 있다. 이 농도의 iodixanol 용액을 C57BL/6 마우스에 투여했을 때 유해한 영향이나 급성 독성이 관찰되지 않았으므로 이 단계는 생략할 수 있다.
   1. 0.5-3 mL 10 kDa 분자량 컷오프(MWCO) 투석 카세트를 PBS에 1분 동안 담가 미리 적신다.
      참고: 투석 막이 매끄러운 상태에서 주름지거나 울퉁불퉁한 모양으로 변해야 한다. 추출된 바이러스의 부피가 10 mL를 초과하는 경우, 0.5-3 mL 투석 카세트 두 개 또는 5-12 mL 투석 카세트 하나를 사용해야 한다.
   2. 필요에 따라 5 또는 10 mL 주사기와 18 G × 1.5인치 blunt-fill 바늘을 사용하여 50 mL conical tube에서 바이러스를 수집한다.
   3. 주사기를 사용하여 투석 카세트에 진입하되 막을 찌르지 않도록 주의하며 바이러스를 주입한다.
      참고: 투석 카세트를 회전시켜 카세트 내 기포의 위치를 조절할 수 있다. 바늘을 카세트에서 제거하기 전에 기포를 제거해야 한다.
   4. 1 L 비커에 멸균된 1× PBS를 채우고 스터 바와 투석 카세트를 넣은 뒤 덮개를 덮는다. 완만한 교반과 함께 4 °C에서 배양한다.
      참고: 압출 폴리스티렌 폼과 고무줄을 사용하여 투석 카세트가 PBS에 뜰 수 있도록 고정한다. ML 버퍼로 인해 카세트가 약간 부풀어 오를 수 있다.
   5. 1-2시간 후 신선한 1× PBS로 교체하고 가벼운 교반과 함께 4 °C에서 8-10시간 더 배양한다.
      참고: 이 과정은 하룻밤 동안 수행할 수도 있다.
   6. 신선한 1× PBS로 한 번 더 교체하고 실온에서 1-2시간 동안 배양한다.
5. 바이러스 용액의 농축
   1. 투석 버퍼에서 투석 카세트를 꺼내어(그림 4C) 작은 밀봉 가능 플라스틱 백에 넣는다. 투석 카세트가 완전히 잠기도록 40% 20,000 MW 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 15-25 mL를 추가한다.
   2. 로킹(rocking)하며 실온에서 배양한다. 5 또는 10 mL 주사기와 18 G × 1.5인치 blunt-fill 바늘을 사용하여 카세트 내 바이러스 부피를 주기적으로 확인한다.
      참고: 바이러스 농축에 필요한 시간은 시작 부피와 원하는 최종 부피에 따라 달라진다. 일반적으로 요막액의 시작 부피와 관계없이 원하는 최종 부피는 1에서 1.5 mL 사이이다. 부피를 확인할 때 동일한 포트를 사용하지 않도록 주의하라. 포트의 무결성이 손상되어 폴리에틸렌 글리콜 용액과 바이러스가 섞일 수 있다.
   3. 농축된 바이러스를 투석 카세트에서 꺼내기 전, 카세트를 1× PBS로 짧게 헹구고 18 G × 1.5인치 blunt-fill 바늘에 공기를 채운다.
   4. 공기가 채워진 주사기를 투석 카세트에 삽입하고 플런저를 누른다. 주입된 공기가 섞이지 않고 농축된 바이러스만 제거될 수 있도록 장치를 회전시킨다.
   5. 농축된 바이러스를 50 mL conical tube에 분주하고 분주된 부피를 기록한다.
   6. 동일한 주사기와 바늘을 사용하여, 이전에 제거한 바이러스와 합쳤을 때 최종 농도가 5% sucrose가 되도록 적절한 양의 60% sucrose를 투석 카세트에 주입한다.
   7. 장갑을 낀 손가락으로 막을 부드럽게 마사지하여 막에 부착되었을 수 있는 잔류 바이러스를 떼어내되, 막이 손상되지 않도록 주의한다. 제거 과정을 쉽게 하기 위해 투석 카세트 내의 과도한 공기를 일부 제거한다.
   8. 이 세척액을 이미 50 mL conical tube에 들어있는 바이러스와 합친다.
      참고: 이제 바이러스는 5% sucrose 상태이며, 20 µL, 50 µL, 100 µL 또는 200 µL 분주량으로 나누어 -80 °C에 보관할 준비가 되었다. 또는 장기 보관을 위해 섹션 2.6에 설명된 대로 NDV를 동결 건조하여 4 °C에 보관할 수 있다.

결과

그림 1: 특정 병원체 제거(SPF) 유정란으로부터의 NDV 감염 및 수확. (A) 9일간의 배양 후에는 배아의 움직임과 더불어 거미줄 모양의 혈관(화살표)이 뚜렷하게 보여야 합니다. 'X'는 융모요막과 기낭 사이의 경계면을 나타내며, 알 접종을 위해 구멍을 뚫어야 하는 위치입니다. (B) 죽은 배아의 이미지입니다. 거미줄 모양의 혈관이 없음에 유의하십시오. 또한 배아의 움직임이 관찰되지 않습니다. (C) 기낭, 난황낭, 양막, 융모요막 및 요막액의 위치를 보여주는 유정란 구성 요소 도식입니다. (D) 융모요막을 노출시키기 위해 껍질을 제거하는 과정입니다. (E) 융모요막을 개방한 후 요막액과 배아의 정상적인 상태를 보여줍니다. 약어: NDV = 뉴캐슬병 바이러스.

그림 2: depth filtration에 사용된 장치의 일반적인 조립도를 나타낸 개략도. 압력계가 depth filter의 상류에 설치되었는지 확인하십시오.

그림 3: 다양한 구성의 접선 유동 여과 장치 설정. 화살표는 유체의 흐름 방향을 나타냄. (A) TFF 카세트 조립 방법 설명. (B) 유체의 정제 및 농축 중에 사용되는 TFF 시스템의 "개방" 구성 모식도. (C) 바이러스 및 세척액의 용출 시 사용되는, 시스템에서 유체가 용출되는 TFF 설정 모식도. (D) TFF 시스템 세척 중에 사용되는 TFF 시스템의 "폐쇄" 구성 모식도. 약어: TFF = Tangential flow filtration(접선 유동 여과).

그림 4: TFF로 농축된 바이러스의 밀도 구배 초원심분리와 투석. (A) iodixanol 밀도 구배의 조성을 나타낸 모식도. (B) 정제 과정 중 ML 버퍼를 사용하여 생산된 바이러스를 초원심분리한 후의 바이러스 밴딩 패턴. 주요 바이러스 함유 밴드는 검은색 타원으로 표시됨. (C) 투석 과정 종료 시 iodixanol 구배를 통해 준비된 바이러스 10 mL가 충전된 투석 카세트의 전형적인 크기. 약어: TFF = Tangential flow filtration; ML = Mannitol-Lysine.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL 슬립 팁 주사기	BD	309659
10 mL 루어-락 주사기	BD	302995
10% 포비돈 요오드 용액	LORIS	109-08
15 mL 원추형 튜브	Thermo-Fisher	14955240
18G x 1 1/2 in 뭉툭한 충전 바늘	BD	305180
18G x 1 1/2 in 정밀 글라이드 바늘	BD	305196
25 G x 5/8 in 바늘	BD	305122
5 mL 루어-락 주사기	BD	309646
빙초산	Thermo-Fisher	A38-212
아가로스	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse 항체	Invitrogen	A11001
Allegra X-14 원심분리기	Beckman Coulter	B08861
과황산 암모늄	BioRad	161-0700
표백제 (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
폭이 넓고 톱니가 없는 팁 핀셋	Thermo-Fisher	09-753-50
브로모페놀 블루	Sigma-Aldrich	114405-25G
Centramate 카세트 홀더	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
Digital 1502 Sportsman 부화기	Berry Hill	1502W
D-만니톨	Sigma-Aldrich	M4125-500G
검란기	Berry Hill	A46
에탄올 (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
암나사 티 피팅, 나일론, 1/8 in NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
습도 키트	Berry Hill	3030
이오딕산올	Sigma-Aldrich	D1556	물에 용해된 60% (w/v) 이오딕산올 용액 (멸균)
L-라이신 모노하이드로클로라이드	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
수나사 및 암나사 루어-락 1/8 in national pipe thread, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S 디지털 드라이브	Cole-Parmer	RK-07522-20	디지털 디스플레이가 장착된 연동 펌프
정밀 튜빙용 Masterflex L/S 이지 로드 펌프 헤드	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex 실리콘 튜빙 (플래티넘) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm 플래티넘 경화 실리콘
Omega Membrane LV Centramate 카세트, 100K	PALL	OS100T02
Optima XE-90 초원심분리기	Beckman Coulter	A94471
PBS 10X 용액	Thermo-Fisher	BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) 평균 Mn 20,000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Slide-a-lyzer 투석 카세트 (고강도), 10,000 MWCO 0.5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
수산화나트륨 (펠릿)	Thermo-Fisher	S318-10
특정 병원균 제거(SPF)란	CFIA	NA	지역에 따라 공급업체가 다를 수 있음
설탕	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 뎁스 필터	PALL	SC050V100P
수술용 가위	Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti 로터	Beckman Coulter	331362	프로토콜 단계 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7에서 사용됨
SX4750 로터	Beckman Coulter	369702
원추형 바닥 튜브용 SxX4750 어댑터	Beckman Coulter	359472
박벽 울트라클리어 원심분리 튜브 (9/16 in x 3 1/2 in)	Beckman Coulter	344059
튜빙 스크류 클램프	PALL	88216
범용 압력계	Cole-Parmer	68355-06